Riassunto analitico
ABSTRACT
L’ormone follicolo-stimolante (FSH) è una glicoproteina che supporta la produzione di gameti. In alcune condizioni di infertilità, sia maschile che femminile, nonché nel contesto della fecondazione assistita, un approccio terapeutico consiste nella somministrazione di FSH ricombinanti o estrattivi. Tali preparazioni commerciali contengono un insieme di molecole di FSH con diversi profili di glicosilazione, quale risultato dipendente dalle cellule di origine e dai metodi di purificazione dell’ormone.
Lo scopo di questo studio è confrontare in vitro due preparazioni di FSH ricombinante, aventi differente pattern di glicoforme e per le quali sono stati descritti specifici eventi clinici, quali un diverso rischio di indurre iper-stimolazione ovarica. A tale scopo, ho valutato l’internalizzazione del recettore dell’FSH (FSHR) mediante endosomi e l’attivazione della via di trasduzione del segnale intracellulare dell’adenosina monofosfato ciclico (cAMP)/proteina chinasi A (PKA).
I preparati confrontati in questo studio sono il Gonal-f® (Merck KGaA, Darmstadt, Germania), prodotto nella linea cellulare epiteliale di ovaio di criceto cinese (CHO), e Rekovelle® (Ferring Pharmaceuticals, Saint-Prex, Svizzera) prodotto nella linea cellulare PER.C6, derivante da cellule retiniche embrionali umane. Le cellule sono state trattate 20 minuti con FSH somministrato nel range di concentrazione 100 pM-1 µM. Al fine di studiare l’internalizzazione di FSHR, la linea cellulare Human Embrionic Kidney 293 (HEK293) è stata trasfettata con plasmidi contenenti i cDNA codificanti FSHR fuso con l’enzima luciferasi (Rluc), e con plasmidi codificanti i marcatori endosomiali, la proteina 5 collegata a Ras (Rab5) e la proteina 7 collegata a Ras (Rab7) usi con la green fluorescent protein (GFP). Rab5 e Rab7 identificano rispettivamente gli endosomi precoci e tardivi.
Per valutare la cinetica di accumulo del cAMP intracellulare, le cellule sono state trasfettate con plasmidi codificanti FSHR e biosensore per cAMP “exchange factor directly activated by cAMP” fuso con Rluc e GFP (EPAC). La cinetica di interazione tra FSHR e i marker endosomiali, nonché la produzione di cAMP, sono stati valutati mediante bioluminescence resonance energy transfer (BRET), in presenza e assenza dell’inibitore dell’internalizzazione Dynasore.
La fosforilazione della proteina cAMP-responsive elements binding protein (CREB) è stata valutata, in cellule trasfettate ed esprimenti FSHR, mediante SDS-PAGE e Western blotting.
L’analisi dell’interazione FSHR-Rab5 mostra che l’internalizzazione del recettore attraverso gli endosomi precoci avviene a livello basale e aumenta nel tempo. Tra le concentrazioni di FSH testate, solo la 10 nM determina un incremento dell’internalizzazione di FSHR rispetto al controllo per entrambe le preparazioni. La concentrazione 1 nM è invece sufficiente a favorire l’interazione tra FSHR e Rab7. Il trattamento con Dynasore inibisce l’internalizzazione di FSHR, sia mediante endosomi precoci che tardivi.
Rekovelle® è risultato essere più potente di Gonal-f® nell’indurre l’accumulo intracellulare di cAMP e la fosforilazione della proteina CREB. Inoltre, Rekovelle® ha azione bifasica nell’attivazione di questa via di trasduzione del segnale, in quanto la concentrazione 1 μM non ha prodotto aumento di cAMP intracellulare, mentre ciò non è avvenuto con Gonal-f® 1 μM. Il trattamento con Dynasore non altera l’attivazione della via intracellulare cAMP/PKA FSH-mediata.
In conclusione, le due preparazioni commerciali di FSH non producono uno specifico pattern di internalizzazione del recettore, ma influenzano l’attivazione della via di trasduzione del segnale cAMP/PKA. Ciò supporta il fatto che, nell’ambito della fecondazione assistita, le due preparazioni potrebbero implicare eventi clinici diversi.
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