Riassunto analitico
I fenilpropanoidi e i flavonoidi sono dei composti naturali di origine vegetale,noti per le loro proprietà salutistiche nell’uomo, importanti per quanto riguarda i processi fisiologici di diverse piante. La loro via biosintetica è composta da diverse reazioni enzimatiche ed è continuamente oggetto di studio nei lavori di ingegneria metabolica. In questo contesto, l’espressione eterologa di proteine ricombinanti nei microrganismi e la biosintesi combinatoriale rappresentano due interessanti mezzi per aumentare le rese di produzione di questi metaboliti secondari della piante.
In questo progetto, l’obiettivo principale è stato creare una piattaforma di produzione per la florizina, un composto bioattivo trovato nella pianta del melo. Tale scopo ha richiesto la ricostruzione della via biosintetica dei fenilpropanoidi/calconi, realizzando dei sistemi modulari da esprimere in E. coli. Per la co-espressione dei diversi geni bersaglio sono stati utilizzati i vettori DUET, forniti dall’azienda Novagen®.
Nella prima fase di questo lavoro sono stati clonati e analizzati a livello funzionale i seguenti geni:
- una sequenza ottimizzata della L-tirosina ammonia liasi isolata da Rhodobacter sphaeroides (RS_TAL);
- la 4-cumarato:coenzima A ligasi isolata da Arabidopsis thaliana (AT_4CL);
- la 4-cumarato:coenzima A ligasi isolata da Malus x domestica (MD_4CL).
L’attività degli enzimi codificati da questi geni ed espressi in un primo modulo, dovrebbe portare alla formazione del 4-cumaroil-CoA a partire dalla L-tirosina.
In dettaglio, alle estremità 5’ e 3’ di RS_TAL, AT_4CL e MD_4CL sono state introdotte mediante PCR le sequenze dei siti di restrizione richiesti per il clonaggio nel vettore DUET selezionato. Tutti i geni amplificati sono stati clonati nel plasmide pCR™8/GW/TOPO®. In questo modo, è stato possibile digerire i geni bersaglio con gli appropriati enzimi di restrizione e clonarli nel vettore finale DUET.
Al fine di verificare le attività enzimatiche, i geni RS_TAL, AT_4CL e MD_4CL sono stati espressi in E. coli: per quanto riguarda RS_TAL è stata osservata la sua capacità di trasformare L-tirosina in acido 4-cumarico. Al contrario, per quanto concerne le proteine ricombinanti 4CL, non è stata rilevata alcuna attività nei confronti del substrato acido 4-cumarico.
Una reazione particolarmente interessante della biosintesi dei fenilpropanoidi è la trasformazione della floretina in florizina, da parte di diverse glicosiltransferasi. In questo studio, la UDP-glucosio glicosiltransferasi (MD_UGT71K1) è stata espressa eterologamente in E.coli, e sono stati eseguiti diversi esperimenti di biotrasformazione. Purtroppo, nelle condizioni selezionate per l’esecuzione di tali saggi non è stata osservata alcuna attività enzimatica da parte di MD_UGT71K1. L’analisi SDS-PAGE e i saggi enzimatici in vitro suggeriscono che la proteina ricombinate MD_UGT71K1 potrebbe essere espressa in E. coli come corpo di inclusione. Alla luce degli gli esperimenti svolti, il protocollo di espressione di MD_UGT71K1 in E. coli richiede ulteriori miglioramenti, anche per confermare le ipotesi avanzate in questo lavoro di tesi.
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Abstract
Phenylpropanoids and derived flavonoids are natural plant products presenting many positive effects on human health. Besides that, they are important compounds regarding several plant physiological aspects. The biosynthetic pathway is composed of several enzymatic steps and is object of many on-going studies on metabolic engineering. In this context, the heterologous expression in microbes and combinatorial biosynthesis are interesting tools to increase production yields of these plant secondary metabolites.
In this project the main goal was to establish a production platform for phloridzin, a bioactive compound found in apple trees, by reconstruction of phenylpropanoid/chalcone pathway as a modular system in a single E. coli cell. For this strategy DUET vectors from Novagen® were used for the co-expression of several target genes.
In a first step, a codon optimised L-tyrosine ammonia lyase gene from Rhodobacter sphaeroides (RS_TAL) and 4-coumarate:coenzyme A ligases from Arabidopsis thaliana (AT_4CL) and from Malus x domestica (MD_4CL), respectively, were cloned and functionally analyzed. These enzymes together would facilitate the formation of 4-coumaroyl-CoA from L-tyrosine in a first module. Suitable restriction sites for subcloning in the selected DUET vector were introduced at the 5’ and 3’ ends of RS_TAL, AT_4CL and MD_4CL sequences by PCR. Then, the genes were cloned into pCR™8/GW/TOPO® plasmid. In this way, the target genes could be digested by appropriate enzymes and cloned directly into the final destination DUET vector. In order to functionally proof enzyme activities, RS_TAL, AT_4CL, and MD_4CL genes were expressed in E. coli cells. RS_TAL showed activity and converted L-tyrosine into 4-coumaric acid, whereas for both 4CL proteins no activity was detectable.
Phloretin itself could be transformed into phloridzin by several glycosyltransferases. In this study the heterologous expression of UDP-glucose-glycosyltransferase (MD_UGT71K1) in E. coli cells was established and several biotransformation assays were performed. Unfortunately under the selected conditions MD_UGT71K1 showed no activity. SDS-PAGE and in vitro enzyme assays suggested that MD_UGT71K1 protein is expressed in inclusion bodies and thus the expression protocol needs further improvement.
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