Riassunto analitico
I chaperoni molecolari sono proteine che interagiscono, stabilizzano e aiutano altre proteine clienti ad acquisire un corretto stato conformazionale funzionalmente attivo. Una delle classi di chaperoni molecolari più studiate è quella delle proteine da shock termico (Heat Shock Proteins/HSPs), di cui fanno parte le small Heat Shock Proteins (sHSPs/HSPB). Questa famiglia comprende 10 membri (HSPB1-HSPB10), i quali hanno un peso molecolare compreso tra 15-30kDa e condividono una significativa similarità di sequenza nel dominio alfa-cristallino. Nonostante l’alta omologia di sequenza, le HSPBs presentano distribuzione tissutale e funzioni differenti. HSPB2 è una molecola di 20kDa ed è espressa ad alti livelli nei muscoli scheletrici e nel cuore, dove modula, con meccanismi ancora sconosciuti, il metabolismo cellulare e la funzione mitocondriale in condizioni di stress cardiaco. HSPB3 è una molecola dal peso molecolare di 17kDa, ed è esclusivamente espressa nei muscoli scheletrici e nel cuore; funzioni specifiche di HSPB3 non sono state finora identificate e descritte. HSPB2 ed HSPB3 sono selettivamente espresse nelle cellule muscolari differenziate. Esse formano un complesso tetramerico con un rapporto HSPB2/HSPB3 di 3:1. Questo complesso ha una carente attività di chaperone molecolare e non interagisce con nessuno degli altri membri della famiglia delle HSPBs. Finora sono state identificate mutazioni in cinque HSPBs associate a disordini neurologici e muscolari e recenti studi hanno identificato in pazienti affetti da Neuropatia Motoria Ereditaria Distale di tipo 2 la mutazione missenso R7S di HSPB3 . Come questa mutazione modifichi la funzione e la stabilità di HSPB3 e del complesso HSPB2-HSPB3 e come dal punto di vista meccanicistico R7S partecipi alla progressione della neuropatia motoria è ancora sconosciuto. A tutt’oggi, invece, non sono state ancora trovate mutazioni di HSPB2 associate a malattie. Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare la distribuzione subcellulare di HSPB2, HSPB3 e del complesso HSPB2-HSPB3 in cellule in coltura (HeLa, HEK293T) e di identificarne eventuali funzioni. Abbiamo inoltre comparato la distribuzione subcellulare ed i livelli di espressione di HSPB3 wild type con il mutante R7S, investigando anche sulla capacità del mutante R7S di associarsi ad HSPB2. Attraverso tecniche di immunofluorescenza e western blot abbiamo sorprendentemente osservato che HSPB2 ed HSPB3 sono localizzate a livello nucleare e perinucleare, dove tendono a formare aggregati. Il mutante R7S è in grado di interagire con HSPB2 e mostra una tendenza ad aggregare, soprattutto nella regione perinucleare della cellula. Abbiamo quindi indagato gli effetti dell’espressione di HSPB2, HSPB3 ed R7S sulla membrana nucleare e su vari corpi nucleari, quali gli speckles, che contengono fattori di splicing, ed i Gemini bodies, che contengono la proteina SMN essenziale per la vitalità e funzione dei motoneuroni. Abbiamo osservato che il pattern di queste strutture nucleari è influenzato drammaticamente dall’espressione di HSPB2, HSPB3 ed R7S. Inoltre,la presenza di aggregati di HSPB2, HSPB3 ed R7S può portare alla parziale distruzione della membrana nucleare. Sulla base delle nostre osservazioni, possiamo concludere che HSPB2 e HSPB3 potrebbero avere un ruolo, non ancora definito, a livello nucleare. Come meccanicamente HSPB2 e HSPB3 alterino il pattern della membrana nucleare, degli speckles e dei Gemini bodies non è ancora conosciuto e sarà obbiettivo di future investigazioni.
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