Riassunto analitico
Il sistema proteolitico dei batteri lattici risulta essere la principale via per il rilascio di peptidi bioattivi a partire dalle proteine presenti nel latte. In lavori precedenti è stato osservato, durante la fermentazione di latte e yogurt con il ceppo Lactobacillus casei PRA205, il rilascio dalle caseine dei tripeptidi Val-Pro-Pro (VPP) e Iso-Leu-Leu (IPP), i quali hanno dimostrata attività anti-ipertensiva in vitro e in vivo.
Le caseine subiscono una prima idrolisi dalla proteinasi di parete (CEP) che libera oligopeptidi dai 5-16 residui, i quali vengono introdotti all’interno delle cellule tramite i sistemi di trasporto e posti all’attività di peptidasi intracellulari che li degradano in di/tri-peptidi e/o amminoacidi singoli.
L’obiettivo di questa ricerca si è focalizzato sulla caratterizzazione dell’attività proteolitica da parte di Lactobacillus casei PRA205 nei confronti di α- e β-caseine, l’estrazione della CEP e sua parziale caratterizzazione biochimica e purificazione seguita da caratterizzazione della X-prolyl dipeptidil aminopeptidasi (PepX), una peptidasi prolina-specifica implicata nella degradazione di VPP e IPP.
Per determinare l’optimum di pH dell’attività caseinolitica del ceppo PRA205, le cellule vive, precedentemente indotte in MCA e risospese in tampone Na-fosfato 0,1 M pH 7,2 a concentrazione finale di 1010 ufc/ml, sono state incubate per 5 ore a 30°C a differenti valori di pH con una preparazione di α- e β- caseine purificate. La maggiore attività enzimatica è stata riscontrata a 50°C e a pH 7,2. Le determinazioni effettuate con la CEP estratta, mostrano invece una temperatura ottimale di 30°C e un optimum di pH a 7,2. Sia il Ca2+ che il Na+ non influiscono sull’attività dell’enzima. Il PMSF (inibitore delle serina-proteasi) determina un’inibizione pressoché completa alla concentrazione di 10mM, mentre l’EDTA (chelante dei metalli di transizione) inibisce l’attività della CEP del 44% alla concentrazione di 10mM.
Nella seconda parte del lavoro di tesi, è stata inizialmente verificata la capacità dell’estratto citoplasmatico di PRA205 di degradare i tripeptidi VPP e IPP. Quest’ultima risultava nella formazione sia di VP/IP che di PP, identificati tramite spettrometria di massa, suggerendo la presenza di due vie di degradazione, che tramite l’analisi dell’effetto degli inibitori (PMSF e EDTA) ci ha fatto ipotizzare il coinvolgimento di due peptidasi citoplasmatiche: PepP e PepX.
In seguito, si è proceduto con la purificazione e caratterizzazione di PepX. L’attività di PepX nel citoplasma, è stata determinata attraverso l’utilizzo di un substrato specifico, Gly-Pro-p-NA, in presenza o meno di inibitori delle peptidasi. L’inibizione da parte del PMSF 5mM è stata completa mentre l’EDTA, alla concentrazione di 10 mM causava una inibizione di circa il 25%.
L’enzima è stato successivamente purificato tramite cromatografia per esclusione molecolare (Sephadex G-100) seguita da cromatografia a scambio ionico (DEAE-cellulose).
L’ enzima purificato mostrava un optimum di pH tra 6 e 7 ed un optimum di temperatura tra 37 e 42°C e ha subito un’inibizione del 60% in presenza di PMSF 1mM e del 5% in presenza di EDTA 10mM. A differenza della CEP, PepX risulta essere attiva anche a basse temperature (55% di attività residua a 5°C).
Quando incubato con VPP e IPP, l’enzima purificato determina il rilascio dei dipeptidi VP e IP, rispettivamente, esplicando l’attività prolina-specifica.
In conclusione, è stata effettuata la caratterizzazione della CEP di PRA205, proteasi responsabile della degradazione di α- e β- caseina e coinvolta nella formazione di VPP e IPP, e valutata l’importanza svolta da PepX nella degradazione di quest’ultimi.
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