• CYP450
• EPILESSIA
• IPPOCAMPO
• LOBO TEMPORALE
• NEUROSTEROIDI

Introduzione
L’epilessia è uno dei disordini neurologici più comuni che colpisce circa 65 milioni di persone nel mondo. Pur essendo l’epilessia del lobo temporale (TLE) la forma più diffusa nel paziente adulto, i meccanismi patologici alla sua base non sono stati completamente compresi. In letteratura è riportato che i neurosteroidi possono avere un ruolo critico nella dinamica della patologia, in quanto sono molecole endogene sintetizzate in seguito alla conversione del colesterolo in pregnenolone ad opera dell’attività enzimatica della colesterolo monoossigenasi (associata al citocromo, P450scc), le quali sono in grado di modulare rapidamente l’eccitabilità neuronale tramite l’interazione con recettori specifici e diversificati. Tra i neurosteroidi maggiormente studiati, l’allopregnanolone ed il pregnanolone agiscono potenziando l’attività inibitoria del recettore di tipo A dell’acido γ-aminobutirrico (GABAA), determinando un effetto anticonvulsivante; al contrario, il pregnenolone solfato è un modulatore negativo del recettore GABAA e, per tale ragione, presenta un’attività pro-convulsivante.
Scopo
In questo lavoro di tesi, lo scopo è stato quello di valutare il coinvolgimento dei neurosteroidi nel modello di TLE basato sulla somministrazione di acido cainico (KA), il quale rappresenta uno dei modelli animali più utilizzati nello studio della patologia in oggetto.
Materiali e Metodi
Ratti Sprague-Dawley maschi adulti (n=57) sono stati divisi in due gruppi. Il primo gruppo ha ricevuto una somministrazione di KA per via intraperitoneale (i.p., 15 mg/Kg), mentre il secondo è stato utilizzato come gruppo di controllo e trattato con soluzione fisiologica. Gli animali appartenenti ad entrambi i gruppi sono stati studiati in un arco temporale compreso tra 3 e 64 giorni dall’iniezione. L’espressione di P450scc è stata studiata in diverse regioni cerebrali, incluso l’ippocampo impiegando la tecnica di immunoistochimica, sia nel gruppo trattato con KA sia nei relativi controlli. Inoltre, negli animali che hanno sviluppato l’epilessia e relativi controlli, sono stati caratterizzati i livelli di diversi neurosteroidi, in particolare il pregnenolone, pregnenolone solfato, progesterone, pregnanolone, 5α-diidroprogesterone (DHP) ed allopregnanolone, in campioni di ippocampo e di corteccia cerebrale mediante un sistema HPLC Agilent 1200 interfacciato con uno spettrometro di massa triplo quadrupolo.
Risultati
Negli animali analizzati dopo 3 giorni dalla somministrazione di KA, il quale ha indotto uno stato di male epilettico (SE), l’espressione di P450scc è significativamente aumentata rispetto ai controlli in due regioni ippocampali, ovvero il CA3 lacunoso-molecolare (CA3LMol) e l’Ilo del giro dentato (DH), ed in una regione extraippocampale, lo striato (CPu). L’espressione di questo enzima, invece, non è risultata essere significativamente alterata rispetto ai controlli nelle restanti aree analizzate: ad esempio, lo strato piramidale del CA3 ippocampale (CA3 Py), il subiculum (Sub), il nucleo reuniens (Re), i nuclei paraventricolari dell’ipotalamo (Pa) e la corteccia entorinale (MEnt). Seppure i livelli di P450scc non siano risultati essere significativamente cambiati negli animali analizzati dopo 64 giorni dall’induzione di SE, i livelli di DHP, pregnanolone e allopregnanolone sono risultati essere significativamente ridotti nell’ippocampo ma non nella corteccia cerebrale.
Conclusione
In conclusione, la via biosintetica dei neurosteroidi è fortemente alterata in seguito all’induzione di SE con KA, come dimostrato dalla riduzione dei neurosteroidi modulatori del recettore GABAA. Tale alterazione potrebbe contribuire alla progressione della malattia nella TLE.

Introduction Epilepsy is one of the most common neurological disorder affecting around 65 million people worldwide. Although the temporal lobe epilepsy (TLE) is the most widespread form in the adult patients, the pathogenic mechanism underlying this disorder haven’t been completely understood yet. In literature, it has been reported that neurosteroids display a critical role in epilepsy, since they are endogenous molecules synthesized after the conversion of cholesterol in pregnenolone by the enzymatic activity of the cholesterol monooxygenase (associated to the cytochrome P450scc). These molecules are capable to rapidly modulate the neuronal excitability through the interaction with specific and diversified receptors. Among the most studied neurosteroids, the allopregnanolone and pregnanolone act enhancing the inhibitory activity of the γ-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor, determining an anticonvulsant effect. At variance, the pregnenolone sulphate is a negative modulator of the GABAA receptor and, for this reason, has a pro-convulsant activity. Object The aim of this thesis was to evaluate the involvement of neurosteroids by using the kainic acid (KA) animal model of TLE. Materials and Methods Adult male Sprague-Dawley rats (n=57) have been divided in two groups. The first group was administered with KA through an intraperitoneal injection (i.p., 15 mg/Kg), while the second group was used as a control group and treated with physiological solution. Animals belonging to both groups were studied until 3 and 64 days after injection. The immunohistochemical staining was used to quantify P450scc expression in different cerebral regions, including hippocampus, of all animals. Furthermore, a HPLC Agilent 1200 system connected to a triple quadrupole mass spectrometer was used to assess the levels of different neurosteroids, such as pregnenolone, pregnenolone sulphate, progesterone, pregnanolone, 5α-dihydroprogesterone (DHP), and allopregnanolone, in samples of hippocampus and cerebral cortex of animals suffering from epilepsy and relative controls. Results In comparison to the control group, the expression of P450scc is significantly increased 3 days after the administration of KA in two hippocampal regions, the CA3 stratum lacunosum-moleculare (CA3LMol) and the hilus of the dentate gyrus (DH), and an extrahippocampal region, the striatum (CPu). Conversely, the expression of P450scc was unchanged after the SE in other analysed areas, such as the hippocampal CA3 pyramidal layer (CA3 Py), the subiculum (Sub), the nucleus reuniens (Re), the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PA), and the entorhinal cortex (MEnt). Similarly, no significant difference was assessed in rats developing epilepsy in comparison to the relative control group. Moreover, the levels of DHP, pregnanolone and allopregnanolone were significantly reduced 64 days after the injection of KA in the hippocampus but not in the cerebral cortex. Conclusion In conclusion, the biosynthetic pathway of neurosteroids is highly altered after the induction of SE with KA, as demonstrated by the reduction of neurosteroids as modulators of GABAA receptor. Such alteration could contribute to the progression of the TLE.