• aggregazione
• Cofilina
• KLHL40
• Mioglobina
• proteinopatia

Un numero sempre maggiore di malattie, chiamate proteinopatie, è caratterizzato dal coinvolgimento di aggregati proteici nella loro eziologia e/o nel fenotipo patologico. Ottimi esempi sono, oltre che alle malattie di Alzheimer e di Parkinson, anche la miopatia nemalinica e alcuni casi di cardiomiopatia dilatativa.
Alcuni casi di cardiomiopatia dilatativa idiopatica sono stati recentemente collegati alla presenza di aggregati proteici composti principalmente da cofilina-2 fosforilata e actina. La cofilina-2 è l’isoforma specifica dei tessuti muscolari della famiglia proteica dei fattori depolimerizzanti dell’actina, la cui attività è controllata da diverse modifiche post traduzionali (MPT), fra le quali la principale è la fosforilazione della serina 3. Curiosamente, nonostante anche per l’altra principale isoforma, la cofilina-1, sono riportati gli stessi elementi regolatori, c’è una risposta patologica alle MPT che è isoforma specifica.
Abbiamo usato un approccio combinato computazionale/sperimentale per investigare il ruolo delle MPT e dello stress ossidativo sulla struttura, dinamica e funzionalità della cofilina-2. Il primo step sono state delle simulazioni di dinamica molecolare (DM) di cofilina-1 e -2, sia fosforilate che non-fosforilate, in cerca di differenze specifiche delle isoforme. Abbiamo scoperto interazioni isoforma-specifiche del gruppo fosfato, che sono però sempre state correlate in un cambiamento delle proprietà elettrostatiche delle due proteine, e un possibile crosstalk fra due altri siti fosforilabili, Ser23/24 e Tyr68. Un’accurata indagine sperimentale ha rivelato una mutua interazione fra la fosforilazione di Ser3 e la risposta della cofilina-2 a stress ossidativi. Inoltre abbiamo ottenuto chiare evidenze della capacità della cofilina-2 di formare aggregati amiloidici, che sono stati già correlati con diverse proteinopatie.
Un secondo target delle nostre ricerche è la stata la mioglobina (Mb), una proteina normalmente presente nei muscoli le cui funzioni sono principalmente il trasporto dell’ossigeno all’interno del tessuto e la regolazione dei livelli di ROS, NO e NO2-. La presenza della mutazione H97Y nella Mb in pazienti affetti da una proteinopatia degenerativa muscolare è stata individuata tramite screening genetico. La comparazione fra Mb wild-type e la variante H97Y con diversi approcci non ha mostrato particolari differenze che potessero essere collegate alla formazione di aggregati, anche se in DM il mutante ha mostrato una aumentata superficie accessibile al solvente del cofattore. Il potenziale redox è stato effettivamente individuato diverso di 20 mV, così come l’interazione con O2 e H2O2, indicando che molto probabilmente la mutazione porta alla malattia in seguito al cambiamento delle proprietà redox della proteina.
Infine abbiamo investigato l’effetto della mutazione E528K della proteina KLHL40 che è stata descritta come causa di miopatia nemalinica, una malattia degenerativa muscolare.
Le proteina della famiglia sono caratterizzate dalla presenza di un dominio Kelch-repeat, che media interazioni proteina-proteina importanti per il funzionamento della proteina e che, nel caso di KLHL40, contiene il sito della mutazione. Abbiamo studiato il suo effetto tramite DM: di nuovo, non abbiamo osservato un effetto destabilizzante della mutazione sulla struttura, ma piuttosto che il residuo mutato è un hub importante all’interno del network di interazione intra-dominio, che è noto essere importante per la sua corretta attività.
I nostri risultati contribuiscono ad una visione in cui le mutazioni che causano proteinopatie non necessariamente sconvolgono la struttura secondaria/terziaria o i livelli di espressione, ma potenzialmente alterano le interazioni con I propri partner fisiologici e la loro attività.

An increasingly large set of diseases, called proteinopathies, is characterized by the involvement of protein aggregates in their etiology and/or in their pathological phenotype. Besides Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, nemaline myopathy and some cases of dilated cardiomyopathy are also notable examples. In some instances, idiopathic dilated cardiomyopathy (iDCM) was recently linked to the presence of protein aggregates composed mainly of phosphorylated cofilin-2 and actin. Cofilin-2 is the muscle-specific isoform of the actin depolymerizing factor protein family, whose activity is controlled by several post-translational modifications (PTMs), principally the phosphorylation of serine 3. Interestingly, although the other main isoform, cofilin-1, was reported to be regulated by the same elements, there is an isoform-specific pathological response to PTMs. We took a combined computational/experimental approach to investigate the role of PTM and oxidative stress on the structure, dynamics and functionality of cofilin-2. The first step was to perform molecular dynamics (MD) simulations of cofilin-1 and -2, both phosphorylated and unpshosphorylated, in search of the isoform-specific differences. Our main findings were the elucidation of isoform-specific interaction of the phospho moiety, which was although always correlated with a change in the electrostatic properties of the two proteins, and a possible crosstalk between two other phospho-site, namely Ser23/24 and Tyr68 was individuated. A thorough experimental investigation revealed an interplay between Ser3 phosphorylation and the oxidative stress response of cofilin-2. Besides, we collected clear evidence of the capability of cofilin-2 to form amyloidic aggregates, that were already correlated with several proteinopathies. A second target of our research was myoglobin (Mb), a protein normally found in the muscles whose functions are mainly to transport oxygen inside the tissue and to help in the regulation of ROS, NO and NO2- levels. Genetic screening revealed the presence of H97Y substitution in Mb in patients affected by a degenerative muscular proteinopathy. The comparison of wild-type (WT) myoglobin with the H97Y variant by different approaches have not shown any particular differences that could have been related with the formation of aggregates, even though in MD the mutant showed an increase in the solvent accessible surface of the cofactor. The redox potential was effectively found to be different by 20 mV, as was the interaction with O2 and H2O2, indicating that most probably the mutation lead to the disease by changing the redox properties of the protein. Eventually, we have investigated the effect of the mutation E528K on the protein KLHL40 that has been individuated as a cause of nemaline miopathy, a degenerative muscle disease. Proteins of this family are characterized by the presence of the Kelch-repeat domain, that mediate protein-protein interaction important for the protein function and that contains, in the KLHL40 species, the site of the mutation. We have studied the effect of the mutation on this domain by MD simulations: again, we did not observe a destabilizing effect of the mutation on the structure, but rather that the mutated residue in an important hub for the intra-domain interaction network, which is known to be important for its proper activity. Our results contribute to a view of proteinopathies-causing mutation as not necessarily disrupting the protein secondary/tertiary structure nor its expression levels, but possibly hampering the interaction with physiological partners or altering their activity.