Riassunto analitico
La simbiosi, definita come un'interazione tra individui di specie diverse, è un importante forza motrice dell'evoluzione animale. Ogni animale è colonizzato da una comunità microbica, per alcuni animali (es. mammiferi, insetti, spugne) molti dei loro simbionti (mutualisti, commensali o patogeni) e dei loro microbiomi (comunità microbiche che vivono dentro e su un organismo) sono stati caratterizzati dettagliatamente. I tardigradi sono micrometazoi idrofili che vivono sia in ecosistemi terrestri che acquatici e sono famosi per la loro capacità di entrare in criptobiosi. Lo scopo della mia tesi è stato quello di incrementare la limitata conoscenza sulle associazioni microbiche dei tardigradi, sia dal punto di vista di singole specie di batteri simbionti, sia del microbioma, anche in relazione con l’ambiente colonizzato dai tardigradi. Come prima cosa ho analizzato la letteratura per disporre di un quadro dettagliato delle interazioni tra tardigradi e microrganismi, escludendo quelli che costituiscono cibo per i tardigradi. Da questa analisi è emerso che le associazioni di tardigradi con microorganismi sono più comuni e diffuse di quanto si pensi, anche se nessuna di queste associazioni è stata caratterizzata e dati sul microbioma dei tardigradi rimangono assenti. Per sopperire a questa mancanza di dati, ho caratterizzato i microbiomi di sei specie di tardigradi limnoterrestri appartenenti a tre diverse linee filogenetiche, in tandem con i microbiomi dei loro rispettivi substrati, mediante l'approccio del metabarcoding del 16S. L'esperimento è stato progettato per analizzare la comunità microbica della stessa specie di tardigrado raccolta in habitat diversi e i microbiomi di specie diverse di tardigrado presenti nel medesimo substrato/habitat, consentendo di determinare gli effetti sia dell'ambiente che della componente genetica dell'ospite sul microbioma. I risultati suggeriscono che il microbioma dei tardigradi è specie-specifico e ben differenziato dall'ambiente. Inoltre, nel microbioma ho identificato quattro taxa batterici appartenenti a due ordini (Holosporales e Rickettsiales) che, comprendendo solo batteri endosimbionti, rendendo questi batteri buoni candidati come endosimbionti di tardigradi. Per meglio caratterizzare questi quattro taxa batterici, ho clonato e sequenziato un frammento del gene 16S e disegnato dei primers per effettuare una PCR diagnostica per rilevare la prevalenza di questi simbionti nelle popolazioni di tardigradi. Il frammento di 16S sequenziato mi ha permesso di stabilire che questi batteri non sono mai stati osservati prima e rappresentano tre nuovi generi e quattro nuove specie. La loro prevalenza nei tardigradi è bassa (dal 10% al 40% a seconda delle specie ospite) suggerendo che questi simbionti batterici non siano essenziali per la sopravvivenza e la riproduzione dell'ospite, ma potrebbero patogeni avere un effetto sulla fitness dei loro ospiti. Inoltre, ho messo a punto un protocollo per l’Ibridazione Fluorescente In Situ (FISH) per localizzare i batteri all'interno del corpo del tardigrado. La FISH ha permesso di localizzare dei batteri nella gonade di una delle specie analizzate (E. trisetosus). I risultati di questa tesi hanno permesso di dimostrare che, come gli altri animali, anche i tardigradi vivono in associazione con microrganismi, in particolare batteri e che queste associazioni sono più comuni di quanto si potesse supporre. Una conoscenza più profonda di queste interazioni potrebbe fornire una maggiore comprensione delle sorprendenti capacità di sopravvivenza agli stress chimico-fisici dei tardigradi; in particolare se i batteri direttamente, oppure attraverso il trasferimento orizzontale di geni dai batteri ai tardigradi, siano responsabili di tali capacità di resistenza.
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Abstract
Symbiosis, defined as an interaction between individuals of different biological species, represents a major force driving animals evolution. Every animal is colonized by a microbial community, and many of them (for example mammals, insects, sponges and so on) have been deeply investigated in their symbiotic relationship with single bacteria species (mutualistics, commensals or pathogens) or in their microbiome (the microbial community living in and on an organism). Tardigrades are hydrophilous micrometazoans living in both terrestrial and aquatic ecosystems, and are famous for their ability to undergo ametabolic states (cryptobiosis). My aim was to increase the limited knowledge on tardigrades microbial associations, both related to single bacteria symbionts and their microbiome, also in relation with their environment. I firstly reviewed the literature and compiled a list of the interactions between tardigrades and microorganisms, excluding those that constitute food for tardigrades. From literature review, it came out that associations of tardigrades with microorganisms (especially bacteria) are more common and widespread than what we thought, however none of these associations was characterized and data about tardigrades microbiome was absent. To supply to this lack of data, I characterized the microbiomes of six limnoterrestrial tardigrade species (Echiniscus trisetosus, Acutuncus antarcticus, Ramazzottius oberhaeuseri, Richtersius coronifer, Macrobiotus macrocalix, Paramacrobiotus areolatus) belonging to three phylogenetic lines) in tandem with the microbiomes of their respective substrates through the 16S metabarcoding approach. The experiment was design to analyze the microbial community of the same species sampled from different substrates, and the microbiomes of different tardigrade species from the same substrate, allowing me to determine the effects of both the environment and the host genetic background on the tardigrade microbiome. The results suggest that the tardigrade microbiome is species-specific and well differentiated from the environment. In addition, from the microbiota data I identified four bacteria taxa belonging to two orders (Holosporales and Rickettsiales) that comprise only endosymbiotic bacteria, making of these bacteria good candidates as tardigrades endosymbionts. To better characterize them, I cloned and sequenced a longer fragment of the 16S gene and I designed diagnostic PCR primers to detect the prevalence of these symbionts infection in their host tardigrades populations. The longer 16S fragment allowed me to establish that these bacteria have never been reported before and represent three new genera and four new species. Their infection prevalence in tardigrades was low (from 10% to 40% according to the different symbiont and tardigrade species) suggesting that these bacterial symbionts are not essential for their host survival and reproduction, but can anyway be beneficial or instead they could be commensals or pathogens. Additionally I set up a Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) protocol to detect bacteria inside the tardigrade body (organs) that allowed to identify bacteria in the gonad of one of the analyzed tardigrade species (E. trisetosus). The work presented here allowed to prove that, as the other animal phyla, also tardigrades live in association with microorganisms, especially bacteria and that these associations are more common than we knew. A deeper knowledge of these interactions could inform us on some of the astonishing survival capabilities of tardigrades, in particular if the bacteria directly, or by horizontally genes transfer from bacteria to Tardigrada, are the responsible for their resistance abilities to chemical-physical extremes.
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