Riassunto analitico
Nel 2016 l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riportato la malattia di Alzheimer (AD) e il cancro colorettale (CRC) tra le principali cause di morte. L'AD è la forma più comune di demenza e si stima che il numero di persone affette da AD debba triplicare tra il 2010 e il 2050. Parallelamente all'AD, il CRC è il terzo tumore più diagnosticato e la quarta causa di morte per cancro nel mondo. Solo grazie allo sviluppo di strategie efficaci, in grado di identificare precocemente queste patologie mortali, le vite possono essere salvate e i costi di assistenza personali, sociali ed economici essere ridotti. Questo rappresenta l’obiettivo di questa tesi di dottorato: la progettazione di radiotraccianti a base di curcumina per la diagnosi precoce di CRC e AD mediante tomografia a emissione di positroni (PET). Questo lavoro inizia considerando la capacità della curcumina di interagire con le cellule tumorali del CRC, innescando il loro processo di apoptosi. Inoltre, la curcumina ha un’elevata affinità e capacità di disgregazione contro le fibrille Aβ1-40 coinvolte nell'AD. Queste capacità ci hanno suggerito di utilizzare la curcumina, e i suoi derivati, come targeting vector (TV) nella progettazione di leganti bifunzionali, dove il chelante è deputato a coordinare il radionuclide. Per trovare il migliore TV è stato eseguito lo screening di diversi curcuminoidi con test in vitro sulle celle tumorali HCT116 e sulle fibrille Aβ1-40. Sono stati considerati anche la stabilità in condizioni fisiologiche, le condizioni di sintesi e le rese di reazione. Tra tutti i composti attivi, sono stati selezionati la curcumina (C21) e il suo derivato senza gruppi metossilici (C31). I loro derivati pirazolici PC21 e PC31 sono stati inclusi nello studio, poiché l'anello pirazolico consente l'inserimento del chelante direttamente sull'eterociclo, invece che sugli anelli aromatici periferici come nel caso di C21 e C31. I chelanti selezionati sono DOTA, NODAGA, Cyclam, DATA e AAZTA. In particolare, tutti i leganti, ad eccezione di quello con il Cyclam, sono stati marcati con gallio-68. Tutti i leganti basati sul chelante AAZTA sono stati marcati anche con scandio-44. Il legante contenente NODAGA come chelante è stato anche testato con fluoro-18 come [Al-18F], mentre quello con Cyclam con rame-64. Prove preliminari di radiomarcatura hanno rivelato che DOTAC21, NODAGAC21, AAZTA31, AAZTAPC21 e AAZTAPC31 risultano promettenti per studi di marcatura più approfonditi. Pertanto, sono state eseguite su questi leganti analisi NMR e LC-MS (ESI). Inoltre, i complessi di natGa-DOTAC21, natGa-NODAGAC21, natSc-AAZTA31, natSc-AAZTAPC21 e natSc-AAZTAPC31 sono stati sottoposti ad esperimenti di frammentazione in ESI-Ion Trap. I complessi puri radioattivi sono stati testati in PBS e siero umano (HS) per un periodo compatibile con scopi diagnostici. Tutti i complessi caldi sono risultati stabili durante i test in vitro. La lipofilicità dei radio-composti è stata misurata a pH 7 in HPLC. Il logD più alto è stato ottenuto per 68Ga-DOTAC21, il cui valore era vicino a 2,5, rendendo questo complesso il candidato più promettente per gli studi in vivo. Guardando l'analisi PET/TC, il tumore era chiaramente visibile dopo un’ora dall'iniezione (rapporto tumore-muscolo (T / M) di 1,91 ± 0,47 (n = 3)). Questo risultato è stato confermato dagli esperimenti di biodistribuzione ex vivo. L'assorbimento nel cervello è risultato trascurabile, il che suggerisce che 68Ga-DOTAC21 non sia in grado di attraversare la barriera emato-encefalica (BEE). Sfortunatamente, questa scoperta preclude l'applicazione di 68Ga-DOTAC21 come radiotracciante per la diagnosi di AD. L'impossibilità di superare BEE di 68Ga-DOTAC21 può essere ragionevolmente estesa a tutti gli altri composti.
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Abstract
In 2016 the World Health Organization (WHO) reported Alzheimer’s Disease (AD) and Colorectal Cancer (CRC) among the main causes of people death. AD is the most common form of dementia and it is estimated that the number of people affected by AD has to triple in 2050 with respect to 2010. In parallel to AD, CRC is the third most commonly diagnosed tumor and the fourth cause of cancer death in the world. By developing effective strategies able to identify early stage of these deadly pathologies, lives can be saved and personal and economic costs of care can be reduced. This represents the driving force of this Ph.D. thesis: the rational design of curcumin-based radiotracers, suitable for early diagnosis of CRC and AD by means of Positron Emission Tomography (PET). Curcumin demonstrated to have antiproliferative activity against CR cancer cells, by activating several biological pathways. Moreover, the molecular structure of curcumin is responsible for its high affinity for Aβ1-40 fibrils, important features involved in the upset of the AD. Therefore, curcumin and its derivatives could be exploited as targeting vector (TV) in the design of bifunctional radiotracers, in which a proper chelator, linked through a spacer to TV, is deputed to coordinate the metal radionuclide. In order to find the best TV, it is reported the screening of several compounds based on in vitro tests on biological targets. Other parameters, like stability in physiological conditions, reaction pathway and yields, were also considered. Among all the active compounds, curcumin (C21) and its derivative without methoxy groups (C31) have been selected as templates. The closure of their keto-enol moieties to pyrazole derivatives PC21 and PC31 have been also included in our ranking, since the pyrazolic ring allows the insertion of the chelator directly on the heterocycle, instead of the peripheral aromatic rings as in the case of C21 and C31. The chelators selected are DOTA, NODAGA, Cyclam, DATA and AAZTA. Specifically, all ligands, except for the one with Cyclam, were labelled with gallium-68. All AAZTA-based ligands were labelled also with scandium-44. The ligand containing NODAGA as chelator was also tested with fluorine-18 as Al-18F, while the one with Cyclam with copper-64. Preliminary radiolabeling tests reveal that DOTAC21, NODAGAC21, AAZTA31, AAZTAPC21 and AAZTAPC31 result to be promising for studies with radioactive metals. Thus, NMR and LC-MS (ESI) analyses were performed on them. Moreover, the complexes of natGa-DOTAC21, natGa-NODAGAC21, natSc-AAZTA31, natSc-AAZTAPC21 and natSc-AAZTAPC31 were synthesized and their structure were confirmed by ESI-Ion Trap fragmentation experiments. The pure hot complexes were tested in PBS and human serum (HS) over a time compatible with diagnostic purposes. All the hot complexes resulted stable during in vitro stability tests in both PBS and HS media. Lipophilicity values of the radio-compounds were measured by an HPLC-based method at pH 7. The highest logD was achieved with 68Ga-DOTAC21, whose value was close to 2.5 and makes this complex the most promising candidate for in vivo studies. Looking PET/CT imaging analysis, the tumour was clearly visible at 1 hour post-injection over background (muscle), with a tumour to muscle ratio (T/M) of 1.91±0.47 (n=3). 68Ga-DOTAC21 was rapidly accumulated in the heart and liver within the first minute of circulation. This result was confirmed by ex vivo biodistribution. Brain uptake was almost negligible suggesting that 68Ga-DOTAC21 is not able to cross BBB. Unfortunately, this finding precludes the application of 68Ga-DOTAC21 as a radiotracer for the diagnosis of AD. The impossibility to pass BBB of 68Ga-DOTAC21 can be reasonably extended to all the other compounds.
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