Riassunto analitico
I contraccettivi ormonali attualmente in uso presentano una serie di effetti collaterali: gravidanze inattese, emicranie, ipertensione, dislipidemia, osteoporosi e trombosi. Per offrire un’alternativa e per evitare gli effetti collaterali citati è stato studiato un contraccettivo non ormonale basato sull’uso di nanoanticorpi (Nbs). A tale scopo sono stati testati due Nbs (NbsA e NbsB) i quali legano allostericamente il recettore dell’ormone follicolo-stimolante (FSHR) andando ad influire sull’azione del recettore. I modulatori allosterici possono influire sull’attività del recettore in modo positivo (PAM), negativo (NAM) o in modo pathway-specifico o biased (BAM). L’FSHR è principalmente espresso sulle cellule della granulosa umane e l’interazione con il proprio ligando, l’ormone follicolo-stimolante (FSH), determina l’attivazione di diverse vie di trasduzione del segnale. Il nanoanticorpo ideale sarà in grado di bloccare l’ovulazione, il picco di LH e la follicologenesi, ma non la steroidogenesi. Mediante l’utilizzo di questi nanoanticorpi non sono previsti effetti collaterali a lungo termine e, soprattutto, si esclude la possibilità di un’infertilità permanente dato che la follicologenesi nelle sue prime fasi è gonadotropina-indipendente. In questa tesi sperimentale sono state studiate, mediante BRET, HTRF e Western Blotting (WB), le due principali vie di trasduzione del segnale mediate dall’FSHR, la via mitogenica e la via steroidogenica, utilizzando la linea cellulare tumorale della granulosa umana (KGN) e le cellule primarie della granulosa umana luteinizzate (hGLC). In particolare, è stato valutato l’accumulo cellulare di Adenosina Monofosfato ciclico (cAMP), il reclutamento della β-arrestina, la produzione di estradiolo (E2) e progesterone (P4), la clivazione della pro-caspasi 3 e la fosforilazione della proteina ERK1/2. È stata inoltre valutata, mediante saggio MTT, la funzionalità mitocondriale direttamente correlata alla vitalità cellulare. I risultati ottenuti indicano che, sia nelle KGN che nelle hGLC, il trattamento con NbsA non riduce i livelli intracellulari di cAMP, ma interferisce con il reclutamento di β-arrestina. Al contrario, il NbsB non ha effetto su entrambe le vie di trasduzione. Il NbsA, al contrario del NbsB, è inoltre in grado di ridurre la fosforilazione di ERK1/2. Entrambi i nanoanticorpi non riducono i livelli di P4, ma il NbsA è il solo in grado di interferire con la produzione di E2. Infine, entrambi i nanoanticorpi non influiscono sulla vitalità cellulare e non favoriscono l’innesco del processo apoptotico. Concludendo, il NbsA agendo da modulatore allosterico BAM è un ottimo candidato per i test in vivo.
|