Riassunto analitico
La cromatografia di affinità per metalli (IMAC-Ion Metallic Affinity Chromatography) è una delle tecniche più utilizzate nella purificazione di proteine ricombinanti. A tale scopo, è molto frequente ingegnerizzare i sistemi proteici da purificare con code d’istidine in posizione C- o N-terminale per aumentarne l’affinità per metalli di transizione quali il rame, il nichel e molti altri. La coda d’istidine, detta comunemente His-Tag, è un segmento polipeptidico composto dalla ripetizione di n monomeri di istidina, con n compreso fra 6 e 9. Questo peptide è ampiamente utilizzato in biologia molecolare sia per la sua capacità di complessare ioni metallici che per le sue dimensioni relativamente piccole, che non interferiscono significativamente con il folding della proteina e con la sua funzione biologica. In questo lavoro di tesi sono state utilizzate le spettroscopie di emissione di fluorescenza e di assorbimento elettronico UV-visibile per studiare le proprietà metallo-leganti della sequenza His-Tag (n=6) inserita in posizione N-terminale del mutante W48A/R129W dell’azzurrina da Pseudomonas aeruginosa. La mutazione R129W ha lo scopo di inserire un fluoroforo in prossimità della coda d’istidine che agisca da efficiente sonda spettroscopica per monitorare la coordinazione di ioni metallici da parte della His-Tag. L’eliminazione del triptofano in posizione 48 (mutazione W48A) consente di eliminare un fluoroforo posto all’interno della struttura proteica, la cui fluorescenza intrinseca avrebbe complicato l’analisi degli effetti sulla fluorescenza del W129 causati dal legame di ioni metallici alla His-Tag. Gli spettri di fluorescenza del mutante W48A/R129W registrati in presenza di concentrazioni crescenti di differenti ioni metallici (Cu2+, Ni2+, Cd2+, Zn2+, Cr3+, Hg2+) rivelano un progressivo spegnimento (quenching) dell’emissione di fluorescenza del W129, la cui entità dipende dalla natura dello ione metallico in soluzione. Lo ione Cu2+ risulta essere il quencher di gran lunga più efficace fra gli ioni metallici utilizzati in questo lavoro. L’analisi delle variazioni osservate nella fluorescenza di emissione del W129 ha permesso di calcolare le costanti di formazione degli addotti formati dalla His-Tag con i differenti ioni metallici, dimostrando come la coda di istidine abbia affinità elevate e confrontabili per tutti gli ioni metallici studiati.
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