Riassunto analitico
La resistenza ai farmaci antimicrobici è uno dei più importanti problemi di salute globale. Un particolare gruppo di batteri, indicato con l’acronimo “ESKAPE”, è stato identificato come il più pericoloso a causa dello sviluppo di meccanismi di resistenza nei confronti della maggior parte degli antibiotici conosciuti. Infatti, un uso scorretto degli antibiotici tra le persone e il loro utilizzo in zootecnia a scopo profilattico, ha causato lo sviluppo di batteri resistenti ai trattamenti antimicrobici convenzionali; ne consegue la necessità di sviluppare nuovi agenti terapeutici per rendere trattabili le infezioni resistenti. Il mio lavoro di tesi, svolto presso l’Università di Barcellona nei gruppi di ricerca della professoressa Yolanda Cajal (Facoltà di Farmacia e Scienze degli alimenti) e il professor Francesc Rabanal (Facoltà di Chimica), si inserisce in un progetto di ricerca volto alla scoperta di analoghi della Polymyxina B (PxB), ma con un miglior indice terapeutico rispetto a questa. PxB è uno degli ultimi antibiotici a cui si ricorre per combattere gravi infezioni causate da batteri Gram negativi multiresistenti. E’ un peptide antimicrobico, caratterizzato da un anello di aminoacidi con residui carichi positivamente e una catena di acido grasso nella parte N-terminale. Sebbene il suo meccanismo di azione non sia ancora completamente chiaro, PxB sembra agire in maniera diversa rispetto ai peptidi antimicrobici convenzionali. In primo luogo stabilisce buone interazioni elettrostatiche con lo strato di LPS, sostituendosi, con le sue cariche positive, agli ioni Ca2+ e Mg2+ presenti sulla porzione esterna del LPS, consentendo pertanto alla porzione idrofobica della molecola di penetrare nello spessore della membrana esterna dei batteri Gram negativi. Una volta all’interno dello spazio periplasmico, PxB sembra indurre un contatto tra le membrane esterna ed interna e uno scambio di fosfolipidi, causando squilibrio osmotico e morte cellulare. PxB mostra una buona attività antibatterica (cioè un basso MIC) ma ha gravi effetti collaterali, principalmente nefrotossicità e neurotossocità.
Sono state testate, attraverso diversi saggi, due serie di composti sintetizzati con modificazioni chimiche della PxB sia sulla catena di acido grasso che sulla struttura ad anello:
- Liposomi con differenti composizioni lipidiche, che mimano le membrane batteriche e quelle delle cellule eucariotiche, sono stati sviluppati per testare la loro interazione con gli analoghi della PxB. Esperimenti di fluorescence resonance energy transfer (FRET) e light scattering sono stati condotti per analizzare meccanismi di fusione/aggregazione di vescicole.
- Monolayers con differente composizione lipidica e con LPS sono stati sviluppati per studiare l’iniziale interazione con le membrane batteriche.
- L’emolisi in globuli rossi di coniglio è stata testata per una preliminare valutazione della tossicità di ogni composto.
- L’attività antibatterica degli analoghi della PxB è stata studiata valutando la loro minima concentrazione inibente (MIC).
- Analisi con il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) sono state condotte per mostrare gli effetti dei nuovi composti sulle membrane cellulari dei batteri.
Nonostante questa attività di ricerca sia stata condotta in vitro, gli interessanti risultati ottenuti in questo tipo di modelli con alcuni analoghi della PxB, incoraggiano fortemente ulteriori valutazioni della loro attività in futuri esperimenti in vivo.
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Abstract
The antimicrobial drug resistance is one of the most important global health issues. A particular group of bacteria, called ESKAPE, has been identified as the most dangerous for their strong mechanism of resistance to most of the known antibiotics. In fact, wrong use of antibiotics in humans and their prophylactic addition in animal husbandry have developed bacterial strains resistant to the conventional antimicrobial treatments; it is therefore necessary to develop new therapeutic agents to make the resistant infections treatable. My thesis work, performed at the University of Barcelona in the research groups of Prof. Yolanda Cajal (Faculty of Pharmacy and Food Sciences) and Prof. Francesc Rabanal (Faculty of Chemistry), was part of a research project aimed at discovering analogs of polymyxin B (PxB) with a better therapeutic index.
PxB is one of the last resort antibiotics to fight severe infections caused by multi resistant Gram negative bacteria. It is an antimicrobial peptide, characterized by a ring of amino acids with positively charged residues and a fatty acid tail in the N-terminus. Although its mechanism of action is still not completely clear, PxB is likely to act differently from the conventional AMPs. First it establishes a good electrostatic interaction with the LPS layer, displacing the positive cations of Ca2+ and Mg2+ and letting it to expand in order to introduce its hydrophobic domain in the outer membrane of Gram negative bacteria. Once in the periplasmic space, PxB seems to induce a contact between outer and inner membrane and an exchange of phospholipids causing osmotic imbalance and cell death. PxB shows a very good antibacterial activity (i.e. low MIC), but it has severe side-effects, mainly nephrotoxicity and neurotoxicity. Two series of compounds, synthesized by chemical modifications of PxB on both the fatty acid tail and the ring structure have been tested in several assays:
- Liposomes with different lipid compositions, mimicking the membrane of bacteria and eukaryotic cells, have been developed in order to test their interactions with the analogs of PxB. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and light scattering experiments have been performed to analyze mechanisms of vesicle fusion/aggregation.
- Monolayers of different lipid composition and LPS have been developed to study the initial interaction with bacterial membranes.
- Hemolysis in rabbit red blood cells has been tested for the preliminary evaluation of the toxicity of each compound.
- The antibacterial activity of PxB analogs has been studied by assessing their minimal inhibitory concentration (MIC).
- Transmission electronic microscope (TEM) analysis has been carried out to show the effects of the new compounds on bacterial cell membranes.
Although the present research activity was performed in vitro, the interesting results obtained in such models with some PxB analogs, strongly encourage further evaluation of their activities in vivo.
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