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Il gruppo di infezioni noto come malattie tropicali trascurate (neglected tropical diseases NTDs) colpisce complessivamente un miliardo di persone nel mondo e rappresenta un onere importante in termini di sofferenza umana. I parassiti della famiglia delle Trypanosomatidae sono agenti di gravi malattie umane, tra cui la malattia del sonno africana e la leishmaniosi. I farmaci attualmente in uso contro le infezioni da Leishmania e Trypanosoma hanno limitazioni in termini di efficacia, sicurezza, durata del trattamento, tossicità e resistenza. Per questi motivi, vi è una forte richiesta di nuovi farmaci efficaci
La via metabolica del folato rappresenta un target di successo per il trattamento delle infezioni batteriche e alcune malattie parassitarie, come la malaria. In teoria, i farmaci che hanno come obiettivo gli enzimi folato-dipendenti dovrebbero fornire candidati utili ad affrontare le infezioni tripanosomatidiche. Tuttavia, gli inibitori classici della diidrofolato reduttasi (DHFR) sono inefficaci contro Leishmania e Trypanosoma a causa della pteridina reduttasi 1 (Ptr1). La Ptr1 è un enzima responsabile del salvataggio delle pterine nei parassiti tripanosomatidi e si sovrappone all'attività della DHFR fornendo un bypass metabolico per attenuare l'inibizione della DHFR. Pertanto, Ptr1 è considerato un bersaglio promettente per lo sviluppo di terapie migliori.
Una libreria di composti naturali è stata sottoposta a screening per la valutazione della attività inibitoria nei confronti della TbPTR1 in vitro e per l'attività antiparassitaria contro i tripomastigoti circolanti di T.b. brucei. I flavonoidi si sono rivelati una interessante classe da valutare come inibitori Ptr1 e agenti antiparassitari. Anche se i flavonoidi sono stati ampiamente esplorati e spesso si possono osservare proprietà pleiotropiche con inibizione promiscua, rappresentano un interessante punto di partenza per il nostro lavoro. Con l'obiettivo di indagare sulle relazioni struttura-attività (SAR), sono state sintetizzate 16 molecole (B1-B16) recanti il classico nucleo flavonoide. Durante lo svolgimento del mio lavoro di tesi sperimentale in Farmacia, sono stata coinvolta sia nella valutazione biologica in vitro della biblioteca sintetizzata che nella sintesi di un nuovo inibitore Ptr1 progettato sulla base dei risultati preliminari. Nel dettaglio, il mio lavoro si è concentrato sulla purificazione della Ptr1 di Trypanosoma brucei e Leishmania major. I saggi biologici hanno evidenziato che il composto 3'-idrossi sostituito sull'anello B (B2) è stato il più potente inibitore TbPtr1 (IC50 = 4.3 M). Per confermare la modalità di legame del flavonolo nel sito attivo della Ptr1 è stata risolta la struttura cristallina ai raggi X di TbPtr1 in complesso con B2. Il gruppo 3'-OH è coinvolto in un legame ad H con la catena laterale di Asp 161. Nel complesso, la biblioteca sintetizzata ha mostrato una buona attività antitripanosoma, con EC50 nella gamma basso micromolare (1-7 M). Con l'obiettivo di aumentare l'affinità di B2 per Ptr1, mi è stato chiesto di sintetizzato l'analogo 3'-amino sostituito (1). Abbiamo seguito una procedura in quattro passaggi: (i) condensazione di Claisen Schmidt per ottenere il nitrocalcone (4); (ii) riduzione del gruppo nitro a corrispondente derivato amminico; (iii) ciclizzazione ossidativa di Algar-Flynn-Oyamada per formare il nucleo flavonolico; (iv) deprotezione con boro tribromuro del gruppo ossidrilico sull’anello A. La struttura chimica del composto ottenuto è stata confermata mediante spettroscopia NMR (1H e 13C) e analisi di massa. La molecola sarà valutata per l'attività inibitoria su TbPtr1 e LmPtr1 e per l'attività antiparassitaria verso T. brucei e L. infantum.

The group of infections known as neglected tropical diseases (NTDs) collectively affects one billion people worldwide and represents an important burden in terms of human suffering. Parasites of the family of Trypanosomatidae are agents of serious human diseases, including African sleeping sickness and Leishmaniasis. Drugs currently in use against Leishmania and Trypanosoma infections have limitations in terms of efficacy, safety, duration of treatment, toxicity and resistance. For these reasons, there is an urgent requirement for new effective drugs. The folate pathway is a successful target for the treatment of bacterial infections and some parasitic diseases, such as malaria. In theory, folate-dependent enzymes targeting drugs should provide useful candidates to face trypanosomatidic infections. However, the classical inhibitors of dihydrofolate reductase (DHFR) are ineffective against Leishmania and Trypanosoma because of Pteridin Reductase 1 (PTR1). PTR1 is an enzyme responsible for the salvage of pterins in parasitic trypanosomatids and it overlaps the activity of DHFR providing a metabolic bypass to alleviate DHFR inhibition. Therefore, PTR1 is considered a promising target for the development of improved therapies. A library of natural compounds have been screened for the in vitro TbPTR1 inhibitory activity and for the antiparasitic activity against T.b.brucei bloodstream form. Flavonoids turned out to be an interesting class to be explored as PTR1 inhibitors and antiparasitic agents. Even though flavonoids have been widely explored and often pleiotropic properties can be observed leading to promiscuous inhibition, they represent an interesting starting point for our work. Aiming to investigate a structure-activity relationship (SAR), 16 molecules (B1-B16) bearing the classical flavonoid scaffold have been synthesized. During my experimental thesis in Pharmacy, I was involved both in the in vitro biological evaluation of the synthesized library and on the synthesis of a designed PTR1 inhibitor. In details, my work was focused on the purification of Trypanosoma brucei and Leishmania major PTR1. The biological assays pointed out that the compound 3’-hydroxy substituted on ring B (B2) was the most potent TbPTR1 inhibitor (IC50 = 4.3 µM). The X-ray crystal structure of TbPTR1 in complex with B2 was solved in order to confirm the flavonol binding mode into PTR1 active site. The 3’-OH group is involved in a H-bond with the side chain of Asp 161. Overall, the synthesized library showed a good antitrypanosoma activity, with EC50 in low micromolar range (1-7 µM). Aiming to increase the PTR1 affinity of B2, I was asked to synthesized the 3’-amino substituted analogue (1). We followed a four-step procedure: (i) Claisen Schmidt condensation to obtain the nitrochalcone (4); (ii) reduction of the nitro group to yield corresponding amino derivative; (iii) Algar–Flynn–Oyamada oxidative cyclization to form the flavonol core; (iv) cleavage of the methoxy group on ring A using boron tribromide. The chemical structure was confirmed by NMR data (1H and 13C) and mass analysis. The molecule will be assessed for the inhibitory activity towards TbPTR1 and LmPTR1 and for the antiparasitic activity towards T. brucei and L. infantum. ACKNOWLEDGEMENT This project has received funding from the European Union’s Seventh Framework Programme for research, technological development and demonstration under grant agreement n° 603240 (NMTrypI - New Medicine for Trypanosomatidic Infections).