Riassunto analitico
Nanoparticelle polimeriche (NPs) e altri nanomateriali sono ad oggi considerati preziosi strumenti in ambito biomedico e tecnologico, ma poco ancora si conosce riguardo la loro interazione con l’ambiente biologico. La superficie di questi nanomateriali una volta a contatto con i fluidi biologici viene rapidamente ricoperta da proteine, che competono per adsorbirsi a livello superficiale formando la cosiddetta “protein corona” (PC). La PC influenza le dimensioni e le caratteristiche superficiali delle NPs conferendo una nuova “identità biologica”: può condizionare la risposta fisiologica alle NPs, determinare reazioni immunitarie e influenzarne la biodistribuzione. Un’approfondita analisi proteomica della composizione della PC risulta pertanto indispensabile per l’analisi dell’intero sistema NPs-PC, in termini di stabilità e funzionalità biologica.
Attraverso questo lavoro di tesi si è cercato di sviluppare, validare e testare un metodo per l’analisi della PC attraverso l’impiego della tecnologia nLC-ESI-Q-TOF-MS. Il metodo da noi sviluppato si basa su una rivisitazione di lavori presenti in letteratura e vanta l’impiego della cosiddetta “digestione on-particle” delle proteine adsorbite sulla superficie delle NPs, che permette di eseguire l’analisi della PC senza desorbire le proteine dalla superficie particellare e garantisce la detection anche delle proteine meno concentrate. Il lavoro di allestimento della metodologia è stato condotto cercando di ottimizzare diversi parametri quali:
• tecnica di quantificazione delle proteine adsorbite;
• purificazione delle NPs dai residui di tensioattivo;
• purificazione del sistema NPs-PC dall’eccesso di proteine presenti nel medium d’incubazione (plasma).
Il metodo è stato inizialmente messo a punto su un sistema semplificato mono-proteico, poi applicato su plasma tal quale e infine su sistemi nanoparticellari utilizzati nel nostro laboratorio incubati in plasma per tempi prestabiliti. In particolare ci si è occupati di studiare la PC dopo incubazione in plasma di NPs di PLGA modificate in superficie con il peptide g7 (direzionante cerebrale), in confronto con NPs di PLGA non modificate (utilizzate come controllo).
I risultati sin qui ottenuti evidenziano come le NPs controllo al pari delle NPs-g7 siano caratterizzate dalla stessa PC costituita da un determinato pool di proteine, indipendentemente dalla concentrazione plasmatica delle stesse proteine. In particolare è importante evidenziare come le proteine caratterizzanti la PC delle NPs, indipendentemente dalla modifica superficiale, non rientrino necessariamente tra le proteine più abbondanti nel plasma, e tra queste in particolare si è evidenziato l’adsorbimento in superficie dell’apolipoproteina E (APO-E). Da un punto di vista funzionale, il coating dell’APO-E sui sistemi nanoparticellari, è considerato da molti autori come una possibile strategia per direzionare farmaci al SNC, anche se studi precedentemente condotti su NPs controllo, hanno evidenziato l’impossibilità di superare la BEE. Al contrario NPs ingegnerizzate in superficie con il peptide g7 hanno mostrato questa capacità funzionale, segno quindi che la presenza di APO-E adsorbita sulla superficie delle NPs non è condizione sufficiente a permettere l’attraversamento della BEE.
Ulteriori studi, che mettano anche in relazione la cinetica di adsorbimento proteico con la cinetica di biodistribuzione particellare in vivo, potrebbero aiutare a comprendere meglio i reali meccanismi che sottendono a questo diverso “comportamento” delle NPs in vivo.
In conclusione, comunque, i risultati per ora ottenuti rappresentano un’importante base per la caratterizzazione a “tutto tondo” di sistemi nanoparticellari più o meno complessi e stimolano a proseguire l’analisi su tali sistemi per disporre in maniera sempre più consapevole e sicura delle potenzialità che l’approccio nanotecnologico offre.
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