Riassunto analitico
Il colesterolo ricopre un ruolo fondamentale a livello cerebrale sia dal punto di vista strutturale che funzionale: è presente nei lipid rafts, è il principale componente della guaina mielinica, partecipa al processo della sinaptogenesi e al rilascio di neurotrasmettitori. Una disregolazione dell’omeostasi del colesterolo a livello cerebrale è stata osservata in diverse malattie croniche neurodegenerative e tale alterazione si riflette con importanti effetti a livello del SNC, portando alla comparsa di alcuni sintomi sia di natura motoria che cognitiva.
Il colesterolo come tale non è in grado di attraversare efficacemente la barriera ematoencefalica (BEE) pertanto per aumentare i livelli fisiologici di colesterolo sono necessari approcci innovativi e tecnologici; ad esempio sembra promettente l’impiego di nanoparticelle, ovvero colloidi (tra 1-1000 nm), che se opportunamente progettati e ingegnerizzati sono in grado di stabilizzare con elevata efficienza il farmaco e accumularsi preferenzialmente al sito target.
Sulla base di queste premesse è stato sviluppato il mio progetto di lavoro, che ha come obiettivo la formulazione di sistemi nanoparticellari costituiti da colesterolo, che in questo caso funge contestualmente da attivo e da materiale di formulazione in grado di autoassemblarsi in strutture nanometriche, che se opportunamente modificate potrebbero diventare efficaci sistemi per trasportare l’attivo a livello cerebrale e renderlo immediatamente disponibile per le funzioni cerebrali.
La prima parte del lavoro di tesi è stata incentrata su studi di preformulazione volti a identificare le migliori condizioni per l’ottenimento di strutture nanoparticellari a base di colesterolo adatte alla somministrazione endovenosa e con dimensioni idonee all’attraversamento della BEE. In questa fase sono stati presi in considerazioni differenti parametri formulativi: tecnica di allestimento, tipo e concentrazione di tensioattivo, volumi e rapporti di fase organica e acquosa, tecniche di purificazione. I sistemi ottenuti sono stati caratterizzati dal punto di vista dimensionale, superficiale (morfologia mediante microscopia AFM e potenziale Zeta) e tecnologico (analisi compositiva della percentuale di tensioattivo residuo e colesterolo nei vettori finali). I migliori risultati sono stati ottenuti formulando i sistemi mediante nanoprecipitazione e impiegando Pluronic F-68 (0,5%, 50 mL) come tensioattivo. Dopo opportuno procedimento di purificazione sono state ottenute nanoparticelle con diametri prossimi a 320 nm e una ridotta dispersità (PDI circa 0,2). Sia le dimensioni che l’indice di polidispersità si riducono ulteriormente aumentando la temperatura di lavoro (45°C). In queste condizioni peraltro si ottengono maggiori rese di preparazione e la percentuale residua di Pluronic nella formulazione finale è compresa tra il 10-18% in peso ovvero idonea a sistemi pensati per la somministrazione endovenosa.
Tali sistemi sono poi stati testati in vitro in collaborazione con il Prof. Grabrucker (Università di Ulm, Germania). Inizialmente è stata valutata l’applicabilità dei sistemi mediante test di tossicità su linee neuronali embrionali; successivamente abbiamo indagato la capacità di tali sistemi di localizzarsi a livello cellulare. Le nanoparticelle sono state allestite utilizzando in questo caso una miscela di colesterolo e colesterolo coniugato a Fitc così da risultare visibili alla successiva analisi al microscopio confocale. Tali sistemi hanno dimostrato un’elevata capacità d’internalizzazione a livello astrocitario.
Gli studi tecnologici descritti in questo lavoro hanno evidenziato l’applicabilità delle nanoparticelle a base di colesterolo come possibili strumenti terapeutici per trattare le carenze di colesterolo a livello cerebrale. Ulteriori studi saranno condotti per modificare la superficie dei sistemi mediante la coniugazione con ligando selettivi nel promuovere il superamento della BEE.
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