Riassunto analitico
L’abetalipoproteinemia (ABL) è una ipobetalipoproteinemia primitiva a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata da livelli plasmatici estremamente ridotti di colesterolo totale e da completa assenza di lipoproteine contenenti l’ApoB (VLDL, LDL e chilomicroni). Le manifestazioni cliniche, presenti fin dall’infanzia, sono : malassorbimento intestinale di lipidi, steatosi epatica e intestinale, acantocitosi, ritardo di crescita, disordini neurologici dovuti a carenza di vitamina E. Il fenotipo biochimico e clinico dell’ABL è dovuto a mutazioni del gene MTTP codificante la proteina microsomiale di trasferimento dei trigliceridi (MTP). La mancata attività funzionale dell’MTP impedisce la lipidizzazione della proteina ApoB che viene degradata a livello intracellulare, impedendo così la formazione e la secrezione di lipoproteine mature (VLDL nel fegato e chilomicroni nell’intestino). Scopo della tesi è stato l’identificazione di una mutazione intronica del gene MTTP, in un paziente con sospetta abetalipoproteinemia, e l’allestimento di una strategia idonea per valutare in vitro l’impatto biologico della mutazione. Il probando è un bambino di 3 anni pervenuto all’attenzione clinica per la presenza di un grave malassorbimento intestinale di lipidi con diarrea cronica e difetto di accrescimento, non associati a manifestazioni neurologiche. Gli esami di laboratorio hanno evidenziato una marcata ipocolesterolemia associata a livelli plasmatici di ApoB e LDL-C non dosabili. Il quadro clinico e biochimico del probando suggerivano la diagnosi di abetalipoproteinemia, per questa ragione è stato analizzato il gene MTTP. L’analisi di sequenza del gene MTTP ha evidenziato la presenza allo stato omozigote della sostituzione nucleotidica TA al nucleotide -11 dell’introne 13 (c.2071-11T/A). Essa non coinvolge direttamente il dinucleotide AG sito accettore canonico di splicing, ma nucleotidi adiacenti comunque rilevanti per un corretto processo di maturazione dell’mRNA. L’analisi bioinformatica condotta con l’algoritmo ASSEDA indicava che la mutazione aboliva completamente il sito canonico accettore di splicing dell’introne 13. Per studiare l’effetto funzionale di questa variante è stata adottata una strategia in vitro che prevede la costruzione di due minigeni MTTP uno contenente la mutazione identificata (minigene mutato) e l’altro privo della mutazione (minigene wildtype). I due minigeni sono stati inseriti in un opportuno vettore di espressione e trasfettati in cellule di mammifero. L’analisi dei prodotti di trascrizione ha dimostrato che il cDNA del minigene mutato aveva dimensioni ridotte rispetto al minigene wildtype a suggerire la perdita di una parte di sequenza codificante. Per verificare questa ipotesi, i cDNA corrispondenti ai minigeni mutato e wildtype sono stati analizzati mediante sequenziamento. L’analisi di sequenza ha dimostrato che nel cDNA mutato l’esone 13 è seguito direttamente dall’esone 15 con l’eliminazione completa dell’esone 14 (exon skipping). La giunzione anomala tra l’esone 13 e l’esone 15 determina uno slittamento della cornice di lettura con la formazione di 2 nuovi amminoacidi seguiti da un codone di stop prematuro in posizione 626. Il prodotto di traduzione di questo mRNA è una proteina MTP tronca di 625 amminoacidi rispetto agli 894 amminoacidi della proteina normale. Questa proteina troncata è priva del dominio di legame con i lipidi e verosimilmente priva di funzione quindi non in grado di assemblare VLDL e chilomicroni. In conclusione abbiamo dimostrato che una mutazione intronica del gene MTTP è una mutazione di splicing che è causa di ABL.
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