Riassunto analitico
La Leucodistrofia a Cellule Globoidi (GLD), conosciuta anche come malattia di Krabbe, è una malattia rara, neurodegenerativa causata dal deficit funzionale dell’enzima lisosomiale galattosilceramidasi (GALC). La forma più comune della malattia e la forma infantile che rappresenta circa l’85% dei casi totali. Il GALC è l’enzima responsabile del catabolismo degli sfingolipidi e un suo deficit funzionale causa l’accumulo del substrato citotossico psicosina (PSY) all’interno delle cellule del sistema nervoso centrale. L’accumulo della psicosina porta all’apoptosi delle cellule di Schwann e degli oligodendrociti provocando demielinizzazione del sistema nervoso centrale e periferico. L’obiettivo di questo lavoro di tesi è la messa a punto di una terapia enzimatica sostitutiva mediata da nanoparticelle (NPs) polimeriche come possibile cura per i pazienti affetti da GLD, in quanto ad oggi i trattamenti disponibili sono solo di supporto per la malattia. L’utilizzo di nanovettori come le NPs è necessaria in quanto l’enzima, a causa delle sue dimensioni di circa 80kDa, somministrato per via sistemica non oltrepassa la barriera ematoencefalica (BEE). Il primo passo del lavoro è stato produrre in laboratorio un GALC murino ricombinante (rmGALC). Questo enzima viene purificato mediante cromatografica per affinità, dal mezzo di coltura di cellule HEK293T modificate geneticamente in modo che producano GALC con un tag di istidina. L’enzima così prodotto è stato poi incapsulato all’interno di nanoparticelle polimeriche formulate utilizzando il copolimero acido poli(lattico-co-glicolico), polimero approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e funzionalizzate con un glicopeptide sintetico (g7) che favorisce il superamento della BEE. Le NPs con rmGALC sono state preparate mediante la tecnica della doppia emulsione con l’aggiunta di due molecole stabilizzanti all’interno della formulazione quali: albumina sierica bovina (BSA) e il Tween 20. Definita la formulazione ottimale sono stati quindi valuti i profili di rilascio delle NPs a diversi pH 7,4 e 5,5 in modo da simulare le condizioni fisiologiche e lisosomiali in cui la NPs tenderà a ritrovarsi. Successivamente è stata valutata la citotossicità di queste particelle a diverse concentrazioni. L’ultimo passaggio è stato testare in vitro l’efficienza di veicolazione delle NPs contenti l’enzima ed il rilascio del rmGALC in cellula. Per questo test sono stati utilizzati fibroblasti estratti da topi wild tipe (wt) e twitcher (twi), modello murino spontaneo per la GLD. I fibroblasti sono stati trattati o con NPs-PLGA-GALC o con solo enzima libero e i trattamenti sono stati eseguiti per 24 e 48 ore. Alla fine del trattamento sono stati valutati i livelli di attività enzimatica sui lisati cellulari. Dai risultati ottenuti si osserva che i fibroblasti twi trattati con NPs-PLGA-GALC mostrano un recupero enzimatico pari al 30% rispetto ai fibroblasti wt. Questo dato evidenzia un potenziale uso delle NPs-PLGA in supporto alla terapia enzimatica sostitutiva.
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