Riassunto analitico
Il colesterolo (Col) è un lipide steroideo presente in tutte le cellule dell’organismo ed in concentrazione elevata nel cervello, dove svolge un ruolo fondamentale sia dal punto di vista strutturale che funzionale. In tale sede, il Col è sintetizzato a livello degli astrociti; la molecola non affluisce attraverso la BEE. In alcune patologie neurodegenerative (corea di Huntington e sindrome di Smith–Lemli–Opitz) è stata riscontrata una carenza della sintesi endogena di Col cerebrale con conseguenze a livello cognitivo e motorio. In caso di deficit della produzione locale, un’efficace terapia di supplementazione richiede approcci innovativi e tecnologici, come l’impiego di vettori nanometrici ingegnerizzati capaci di superare la BEE ed accumularsi al sito target.
Sulla base di queste premesse, durante la mia tesi di Laurea sono stati allestiti e ottimizzati nanosistemi ibridi di PLGA e Col, variando diversi parametri formulativi come il metodo di preparazione (nanoprecipitazione ed emulsione semplice), il tensioattivo, il rapporto tra i componenti del sistema e la tecnica di purificazione, così da ottenere sistemi stabili, con caratteristiche morfologiche, strutturali e dimensionali (valutate mediante analisi PCS, microscopia AFM e STEM, analisi compositiva) adatte alla somministrazione, degradabili e cedibili Col. L’utilizzo del composto terapeutico come elemento strutturale del vettore è proposto come metodologia per limitare effetti collaterali connessi all’accumulo a livello periferico e del sito patologico di materiali non funzionali.
I campioni che mostravano le migliori caratteristiche, dimensioni medie <280 nm, basso indice di polidispersione (PDI<0,3), stabilità in sospensione e contenuto di Col >35%, sono stati selezionati ed ingegnerizzati introducendo PLGA modificato con i) molecola fluorescente (rodamina) come tracciante e/o ii) l’eptapeptide simil-oppioide g7, in grado di promuovere il superamento della BEE. I vettori modificati sono stati ampiamente caratterizzati, dimostrando proprietà strutturali e stabilità analoghi ai vettori non modificati.
I sistemi ottimizzati e selezionati sono stati testati in culture primarie di neuroni ippocampali, in collaborazione con il Prof. Grabrucker (Università di Ulm, Germania). Tali studi sono volti a valutare la tossicità dei nuovi vettori e ad individuare i meccanismi coinvolti nell’uptake, così da ipotizzare il destino intracellulare e l’effettiva possibilità di cessione del Col in compartimenti utili.
La buona tollerabilità dei campioni (modificati e non modificati) è stata dimostrata mediante test annessina propidio ed indagine Western Blott di proteine coinvolte nel processo apoptotico.
Successivamente l’attenzione si è spostata sulla determinazione dell’efficienza di internalizzazione dei vettori ibridi in neuroni e cellule gliali e sull’indagine del meccanismo di ingresso nelle cellule mediante tecniche di immunocitochimica, così da definire eventuali differenze rispetto alle più conosciute e note al gruppo di ricerca nanoparticelle di PLGA e studiare il possibile destino intracellulare.
Dimensioni, composizione e caratteristiche superficiali sono risultate determinanti nell'influenzare l’affinità ed il meccanismo di ingresso cellulare. In particolare, i vettori ibridi non modificati con g7 mostrano modalità di uptake diverse rispetto alle nanoparticelle di solo PLGA, suggerendo nella composizione ricca in Col un parametro di discriminazione della capacità di uptake.
Tali differenze diminuiscono quando i vettori ibridi sono modificati in superficie con g7, a dimostrazione dell’avvenuta esposizione del peptide in superficie e della sua rilevanza nell'internalizzazione in cellule neuronali (endocitosi clatrina-dipendente e accumulo in vescicole RAb5 positive e lisosomi).
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