Riassunto analitico
Il presente lavoro di tesi sperimentale di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, svolto presso il laboratorio di “Fitochimica e Prodotti Naturali Bioattivi” del Prof. J.L.Wolfender dell’Università di Ginevra nell’ambito del programma Erasmus+ (coordinatore Prof.ssa Federica Pellati), ha avuto come obiettivi principali la valutazione dell’attività antifungina (contro Candida albicans) di un estratto ottenuto da una co-cultura di due specie fungine (Fusarium sp. e Cladosporium sp.) e l’isolamento dei composti responsabili dell’attività antifungina attraverso un frazionamento cromatografico bio-guidato.
Si è deciso di studiare una co-cultura caratterizzata dalla presenza di un Fusarium sp. e di un Cladosporium sp., perché in un precedente lavoro di screening era stata individuata un’inibizione a distanza tra queste due specie fungine, in cui la crescita di un fungo si arresta a una certa distanza dall’altro. Tale morfologia permette di ipotizzare la produzione e il rilascio di molecole nel mezzo di cultura con attività antimicotica da parte di uno o di entrambi i funghi.
Questi funghi sono stati quindi posti in co-cultura, estratti ed è stato fatto il test bio-autografico anti-candida per avere dei risultati preliminari sulla bioattività delle molecole prodotte.
Visti gli esiti positivi del test biologico sono state fatte crescere 200 co-culture, estraendo separatamente la zona di crescita del Fusarium, la zona di crescita del Cladosporium e la zona di interazione dei due, chiamata zona di confrontazione, per avere la quantità necessaria per le successive analisi, test antifungini e frazionamenti.
In questo progetto ci si è focalizzati sulla zona di interazione dei due funghi, dove probabilmente si concentrano i metaboliti attivi indotti: è stata fatta un’analisi HPLC dell’estratto e un successivo frazionamento tramite un sistema di High Performance Flash Chromatography “Puriflash”. Per passare dalla cromatografia analitica alla flash è stato applicato un metodo di transfer geometrico, verificato previamente per mezzo di una miscela di quattro composti standard, in modo da mantenere lo stesso profilo cromatografico e la stessa selettività in entrambi i sistemi.
Le frazioni ottenute sono state testate nuovamente sulla Candida albicans mediante il test bio-autografico per confermare l’attività antifungina e sono state individuate diverse zone attive.
Il metodo cromatografico analitico HPLC è stato quindi ottimizzato, per separare meglio i composti nella zona di attività visualizzata con il test biologico e per ridurre al minimo le co-eluizioni. Dopo aver applicato il transfer, è stato effettuato un frazionamento più accurato in un numero molto maggiore di porzioni con il sistema High Performance Flash Chromatography “Puriflash”, in modo da avere una prima, approssimativa purificazione dell’estratto. Tali porzioni sono state testate sempre sulla Candida albicans e, dopo aver individuato le frazioni con attività antifungina, sono state analizzate tramite un sistema UPLC-TOF-MS per identificare i features responsabili di questa attività ed avere un’idea della purezza di ogni frazione.
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