Riassunto analitico
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa ad insorgenza adulta, caratterizzata dal punto di vista clinico dalla progressiva degenerazione dei motoneuroni superiori ed inferiori. Alterazioni in diversi geni sono state correlate a SLA ma le esatte cause che portano a degenerazione dei motoneuroni sono ancora sconosciute. Inoltre, ad oggi, non è ancora stata identificata una terapia efficace. Mutazioni nella proteina TANK-binding kinase 1 (TBK1) sono state correlate a SLA solo recentemente ed attualmente si sa ancora poco riguardo al suo ruolo nella patogenesi di questa patologia. L'obiettivo di questa tesi è quello di individuare le alterazioni fisiopatologiche associate a mutazioni in TBK1 per caratterizzarne e correggerne il fenotipo patologico. Per questo scopo, abbiamo generato cellule staminali pluripotenti indotte di un paziente SLA, portatore una mutazione loss-of-function 358+2T>C nel gene codificante per TBK1 e abbiamo differenziato queste cellule in motoneuroni. Utilizzando questo modello in-vitro abbiamo trovato che i motoneuroni portatori di una mutazione inTBK1 sono caratterizzati da aploinsufficienza di TBK1 e ridotta attivazione del recettore autofagico p62, che di conseguenza si accumula nella sua forma non fosforilata in aberranti aggresomi citosolici. Inoltre, abbiamo osservato un' incrementata morte neuronale nelle culture derivate dal paziente SLA rispetto alle cellule sane usate come controllo ed, in accordo, alterazioni nell'omeostasi mitocondriale e maggiori livelli di proteine pro-apoptotiche. Mutazioni in TBK1 causano anche una drammatica alterazione della composizione molecolare delle sinapsi eccitatorie, suggerendo così una riduzione detrimentale dell'attività neuronale. Infine, considerando le alterazioni che caratterizzano i motoneuroni mutati in TBK1, abbiamo testato una libreria di piccole molecole leganti i canali ionici, ponendoci come obiettivo quello di correggere il fenotipo correlato a SLA. Abbiamo trovato che la Nimodipina e l’Amiodarone, due antagonisti del Ca2+, già approvati da FDA ed utilizzati in terapia, riducono il carico di aggregati proteici positivi per p62 all'interno del soma dei motoneuroni mutanti. Queste ultime osservazioni risultano particolarmente interessanti poiché suggeriscono che la regolazione dei canali del Ca2+ potrebbe essere una strategia terapeutica promettente per la cura della SLA.
|
Abstract
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset fatal neurodegenerative disease, clinically characterized by the progressive degeneration of upper and lower motoneurons. Alterations in several genes have been correlated with ALS, but the exact causes leading to motoneuron degeneration are still unknown. Moreover, up to date no effective therapy has been found.
Mutations in TANK-binding kinase 1 (TBK1) have been only recently linked to ALS and still very little is known about its contribution to ALS pathogenesis.
In this thesis, we aimed to investigate the pathophysiological alterations associated with mutations in TBK1 gene in order to characterize and to rescue the detrimental ALS phenotype. To do this, we generated hiPSCs from one ALS patient harboring a 358+2T>C loss-of-function mutation in TBK1 gene, and differentiated them into motoneurons. Using this in-vitro model, we found that mTBK1 motoneurons are characterized by TBK1 haploinsufficiency and reduced activation of the autophagic receptor p62, which as a consequence accumulates in its unphosphorylated form into aberrant cytosolic aggresomes. Moreover, we observed increased neuronal loss in cultured mutant motoneurons when compared to healthy control and, accordingly, alterations in mitochondrial homeostasis and increased levels of pro-apoptotic proteins. Interestingly, mutations in TBK1 lead also to a dramatic alteration of the molecular composition of excitatory synapses, suggesting a detrimentally decreased neuronal activity.
Finally, based on the dramatic alterations characterizing mutant motoneurons, we screened for a small-molecule library of ion-channels ligands in order to rescue the ALS-related phenotypes. We found that two known, FDA-approved Ca2+ blockers, Nimodipine and Amiodarone, reduce the load of p62-positive protein aggregates within mTBK1 MNs. These last findings are particularly noteworthy because they show that the regulation of Ca2+ channels might be a promising therapeutic strategy in ALS.
|