Riassunto analitico
Il presente lavoro di tesi sperimentale, svolto presso il laboratorio di Tossicologia Forense dell’Università di Modena e Reggio Emilia, ha avuto come obiettivo lo studio della stabilità della cocaina e dei suoi metaboliti in matrice ematica. Lo studio si è articolato in due fasi successive: nella prima fase è stata valutata la stabilità in vitro di cocaina e relativi metaboliti su campioni bianchi di sangue drogati con gli analiti di interesse al fine di confutare o meno i dati di stabilità presenti in letteratura; nella seconda fase sono stati analizzati 24 campioni di sangue provenienti da soggetti trovati positivi per cocaina e metaboliti in precedenti indagini del 2016. Tutti i campioni analizzati hanno subito il medesimo processo di purificazione che prevede la precipitazione delle proteine ematiche e poi il clean-up del surnatante ottenuto mediante colonnine SPE-Phree per la rimozione dei fosfolipidi. La successiva analisi LC-MS/MS è stata effettuata su colonna Synergi™ Polar-RP 80 Å (150 x 2.0 mm; 4.0 µm) a 40°C con eluizione a gradiente ed acquisizione MRM (multiple reaction monitoring) in modalità di ionizzazione positiva. Per l ‘analisi quantitativa sono state allestite curve di calibrazione in matrice utilizzando come IS gli analoghi deuterati degli analiti di interesse (cocaina-d3 e benzoilecgonina-d3). Al termine del periodo di studio (46 giorni) i campioni in vitro, come tali e trattati con NaF quale inibitore delle colinesterasi, hanno mostrato un deciso calo nel tempo del livello di cocaina, in linea coi dati riportati in letteratura, mentre nei campioni reali l’analisi effettuata a distanza di 1 anno ha mostrato un calo percentuale in cocaina fortemente influenzato da differenze interindividuali. I risultati ottenuti in questo lavoro di tesi forniscono ulteriori informazioni sulla stabilità degli analiti target nei campioni ematici. Nell’ambito tossicologico-forense questo risulta di importanza primaria ai fini di una corretta interpretazione dei dati analitici; ciò è tanto più vero se si considera che i campioni non sempre vengono analizzati subito dopo il prelievo e che spesso vengono richieste analisi supplementari o di conferma a distanza di vari mesi.
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Abstract
This experimental thesis work, conducted at the Forensic Toxicology Laboratory at University of Modena and Reggio Emilia, aims to study the stability of cocaine and its metabolites in the blood matrix.
The study was structured in two successive phases: in the first phase, the in vitro stability of cocaine and its metabolites on blank blood samples, spiked with the target analytes, was evaluated in order to compare the results with the stability data in the literature; In the second phase, 24 blood samples coming from subjects founded positive to cocaine and metabolites in previous investigations of 2016, were re-analyzed.
All the analyzed samples underwent the same processing, that involves the precipitation of blood proteins and then the supernatant purification by SPE-Phree columns for removing the phospholipids. The next LC-MS / MS analysis was carried out at 40 ° C on a Synergi ™ Polar-RP 80 Å (150 x 2.0 mm, 4.0 μm) column with gradient elution and MRM (multiple reaction monitoring) data acquisition in positive ionization mode.
For the quantitative analysis, matrix calibration curves were calculated using the deuterated analogs of the target analytes (cocaine - d3 and benzoylecgonine - d3).
At the end of the study period (46 days), all in vitro sample untreated and treated with NaF (as a cholinesterase inhibitor), showed a remarkable drop in cocaine concentration, in agreement with literature data; While the real samples, re-analyzed after one year, pointed out a drop in cocaine level strongly influenced by inter-individual differences.
The results obtained in this thesis work provide more information on the stability of the target analytes in blood samples. In the toxicological-forensic field, this is of primary importance for the correct interpretation of analytical data; this is particularly more true if we consider that samples are usually analyzed not shortly after being collected and that additional analysis or remote confirmation after several months are often required.
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