Riassunto analitico
The present research was carried out in the laboratory of Prof. Coral Barbas, at the Center for Metabolomics and Bioanalysis (CEMBIO) of the Faculty of Pharmacy of the CEU-San Pablo University of Madrid, in the ambit of the Erasmus+ Program (coordinator Prof. Federica Pellati) and under the supervision of Prof. Joanna Godzien.
Nontargeted metabolomics is a powerful high-throughput analytical approach, capable to unravel the yet-not-comprehended mechanisms of pathologies and discover biomarkers of disease. However, this approach suffers several limitations. Identification process in nontargeted metabolomics is known to be the major bottleneck in the whole procedure. The main reason for this is the great variety of chemicals in the human metabolome, together with the lack of pure standards for chemical structure confirmation and the limited amount of available information from databases. For these reasons, characterization of metabolites appears to be a major priority for the development of metabolomics.
The study presented in this work focuses on the characterisation of the oxidation products of 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAPC). The interest in these products comes from their role in both pathogenesis of a great number of oxidative stress-related diseases.
The aims of the present study are:
The measurement of the accurate masses of the oxidation products of PAPC by mean of a liquid chromatography-mass spectrometry technique;
The research of diagnostic signals for a rapid and reliable identification of oxidation within the phosphocholines based on tandem mass spectrometry;
The elucidation of the product fragmentation pattern produced by the collision induced dissociation (CID) tandem mass spectrometry.
In order to achieve these goals, in the present study a liquid chromatography-mass spectrometry-hyphenated technique (LC-MS) was employed and an oxPAPC standard (Avanti Polar Lipids, Inc. AL, USA) purchased. The wide range of metabolite coverage of LC, as well as the high sensitivity and accurate mass detection of a Q-TOF (quadrupole-time of flight) mass spectrometer, made this technique the most appropriate one for this study.
After making a list from the scientific literature of all the known possible products arising from PAPC oxidation, an MS analysis was set in order to take a fingerprint of the standard mix. This allowed more masses to be added to the list for the tandem mass spectrometry (MS2) experiment. MS and MS2 spectra were inspected with Mass Hunter Qualitative software (Agilent, B.06.00).
In conclusion, in this study, accurate masses in both MS negative and positive mode of PAPC’s oxidation products were measured. The fragmentation pattern allowed the identification of these products as well. Furthermore, the diagnostic signals indicating the presence of oxidation within PCs were defined. These data are stored in an in-house database accessible to the database-mediator “CEU mass mediator” (CMM). Furthermore, a new functionality will be added to CMM for the identification of oxidized fatty acids from oxidized phosphocholines and semi-automated recognition of oxidation type.
|
Abstract
La presente Tesi Sperimentale di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stata realizzata nell’ambito del programma Erasmus+ tra il Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia e la Facoltà di Farmacia dell’Università CEU San Pablo di Madrid (coordinatore Prof. Federica Pellati). L’attività sperimentale della seguente ricerca è stata svolta presso i laboratori del “Center for Metabolomics and Bioanalysis” (CEMBIO), sotto la supervisione scientifica della Prof. Joanna Godzien.
La metabolomica esplorativa (“nontargeted metabolomics) è un approccio analitico cosiddetto su larga scala, capace di definire i processi biochimici ancora incompresi alla base della patogenesi delle malattie e in grado inoltre di scoprire nuovi biomarcatori di patologia. Tuttavia, questo approccio presenta alcune importanti limitazioni che, ad oggi, ne vincolano ancora le grandi potenzialità. Il principale responsabile di tali limitazioni è, probabilmente, la fase di identificazione dei composti presenti nei campioni biologici. Questo si deve principalmente all’ enorme variabilità chimica del metaboloma umano, a cui conseguono la mancanza di disponibilità di standard chimici dei metaboliti e l’inadeguatezza delle banche dati disponibili al pubblico. Appare dunque ovvio che la caratterizzazione dei metaboliti presenti nel metaboloma umano sia tuttora una necessità per lo sviluppo della metabolomica.
Il presente lavoro si è pertanto incentrato sulla caratterizzazione dei prodotti dell’ossidazione dell’1-palmitoil-2-arachidonil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (PAPC). L’interesse per questa particolare classe di metaboliti si deve al loro importante ruolo nella patogenesi di alcune patologie correlate all’insorgenza di uno stato di stress ossidativo.
Lo scopo di questo studio si può riassumere in tre punti centrali:
I) La misurazione delle masse accurate dei prodotti dell’ossidazione di PAPC attraverso una tecnica combinata di cromatografia liquida e spettrometria di massa.
II) L’identificazione dei segni diagnostici in grado di determinare in modo rapido e sicuro la presenza di ossidazione nella struttura delle fosfatidilcoline.
III) Lo studio degli spettri di frammentazione generati tramite tecnica di dissociazione indotta da collisione nell’ambito della spettrometria di massa tandem dei suddetti prodotti.
Per ottenere il raggiungimento di questi obiettivi, è stata impiegata una tecnica di cromatografia liquida accoppiata con una di spettrometria di massa (LC-MS. La scelta della tecnica LC-MS rispetto ad altre comunemente utilizzate nel campo della metabolomica è dovuta alla capacità della cromatografia liquida di imporre condizioni di separazione adatte a soddisfare l’ampia diversità chimica del metaboloma ed alla grande sensibilità e accuratezza nella misura della massa dello spettrometro di massa Q-TOF (quadrupolo-tempo di volo).
A seguito di una ricerca bibliografica volta a definire una lista di composti target, una analisi MS è stata compiuta con lo scopo di definire “l’impronta digitale” dello standard ed includere nuovi target per la successiva ricerca. In seguito un esperimento di spettrometria di massa tandem ha reso possibile con la tecnica CID di ottenere gli spettri di frammentazione dei composti target.
In questo studio sono state misurate con successo le masse in modalità positiva e negativa di alcuni dei prodotti dell’ossidazione di PAPC. Lo studio della frammentazione dei composti studiati ne ha permesso inoltre l’identificazione. Inoltre, alcuni segni diagnostici della presenza di ossidazione nella fosfatidilcolina sono stati definiti. Questi dati saranno in futuro utilizzati per la costruzione di una libreria “indoor” che sarà resa accessibile attraverso il mediatore
|
