• biospettroscopia
• Exosomi
• membrana lipidica
• MoS2
• Nanotossicità

Dopo la scoperta di nuovi metodi per l’esfoliazione meccanica della grafite, analoghe strutture di natura inorganica sono state preparate e caratterizzate ed ottimi risultati sono stati ottenuti con il bisolfuro di Molibdeno (MoS2). Le singolari caratteristiche fisico-chimiche di tale materiale, tra cui forte resistenza meccanica e conduttività termica, elevata area superficiale, notevole biocompatibilità e facilità di funzionalizzazione hanno attratto un interesse significativo in numerosi campi di ricerca, che spaziano dall’elettronica alla nano medicina. Per tale ragione, prima di un’esponenziale utilizzo in campo industriale, è fondamentale esplorare l’eventuale uptake, citotossicità e la risposta infiammatoria che tale materiale può provocare in seguito a diversi livelli di esposizione nell’uomo.
In questo studio sono stati coltivati monociti umani del ceppo THP-I, differenziati con phorbol 12-myristate 13-acetate e trattati con il nanomateriale alla concentrazione di 1 µg/ml per 24 ore, già dimostrata subletale. L’effetto del trattamento è stato monitorato con spettroscopia IR e differenze sono state riscontrate tra i due campioni con l’evidente presenza di prodotti di ossidazione lipidica nelle cellule trattate. Inoltre, è stata costruita una libreria di spettri dei lipidi generalmente presenti nelle membrane cellulari. E’ nota, infatti, l’importanza dei lipidi e del loro rapporto nella costituzione delle membrane cellulari poichè particolari variazioni potrebbero essere marker di alcune forme cancerose nel primo stadio di sviluppo.
Anomalie lipidiche sono state riscontrate anche a livello della membrana che circonda gli exosomi, ottenuti con tecnica di ultracentrifugazione differenziale a partire dal supernatante raccolto dalle colture cellulari. Gli exosomi sono vescicole di dimensioni nanometriche di origine endosomiale ottenute in seguito alla fusione con la membrana plasmatica. Tali vescicole sono normalmente prodotte dalle cellule e sfruttate per la comunicazione intercellulare e per il trasporto di macromolecole biologiche in vari distretti dell’organismo, ma particolari stimoli esterni possono incrementare tale produzione. Recenti studi, hanno dimostrato la presenza di tre categorie vescicolari: “large” e “small” exosomi con diametro tra 90-120 nm e 60-80 nm rispettivamente e “exomeri”, vescicole prive di membrana lipidica con diametro di circa 35 nm.
Gli exosomi oggetto di tale studio sono stati sottoposti a ELISA e Western blot per riscontrare la presenza del più comune biomarker di tali vescicole, la tetraspanina CD63. Invece, i risultati ottenuti con Nanoparticle Tracking Analysis hanno evidenziato la presenza di una sola popolazione con diametro di circa 100 nm ottenuta dalle cellule trattate con MoS2 in contrapposizione ai controlli dal quale si ottengono vescicole con ampio range dimensionale dovute alla naturale variabilità delle suddette vescicole. Tale importante risultato è stato supportato da immagini ottenute con microscopia elettronica. In aggiunta, spettri FTIR di exosomi sono stati raccolti e sottoposti a prepocessing. L’analisi dei Principal Components (PCA) è stata effettuata per esplorare l’origine delle differenze biochimiche che possono distinguere le due popolazioni di exosomi. I dati rivelano differenze nella composizione lipidica e proteica, dimostrando una reazione intracellulare da parte dei campioni trattati.
Numerose analisi possono ancora essere effettuate ma tale studio rappresenta il primo passo verso la scoperta dell’ importanza degli exosomi nel signalling cellulare in seguito all’esposizione a tale nanomateriale ed una sua eventuale nanotossicità.

After the discovery of new methods to produce large quantities of exfoliated graphene, a host of other analogous inorganic nanotubes have been prepared and characterised, such as Molybdenum disulphide (MoS2). The unique properties that this 2D nanomaterial has shown can be exploited in applications ranging from cutting edge electronic devices to nanomedicine. However, before translation into industrial or biomedical arenas, the question of MoS2 cytotoxicity, uptake and inflammatory response should be addressed, to understand the potential health impacts following different levels of exposure. In this study, 20 flasks of Human acute monocytic leukaemia (THP-1) cells were cultivated, differentiated in macrophages with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and treated with the nanomaterial at the concentration of 1 µg/ml for 24 hours, already demonstrated to be sublethal in previous studies. The effect of the treatment was monitored using IR spectroscopy and the presence of oxidated lipid products in the treated species was demonstrated. In addition, a library of lipid spectra was built to evaluate the difference in lipid composition of the cellular membrane after the treatment. It is now well established, indeed, that upregulation of de novo lipid synthesis, especially fatty acid synthesis, is an early event in carcinogenesis and a hallmark of many cancers because, during mitosis, cells have to provide a huge amount of lipids in order to build new membranes. The excess lipids were identified to be present in the form of exosomes, which were obtained from the supernatants of the cell cultures by ultracentrifugation. Exosomes are nanosized extracellular membrane vesicles (EVs) (60-120 nm in diameter) of endosomal origin released from cells after fusion with the plasma membrane. Recent works showed that two exosome subpopulations (large exosome vesicles, Exo-L, 90–120 nm; small exosome vesicles, Exo-S, 60–80 nm) could be distinguished and also an abundant population of non-membranous nanoparticles termed ‘exomeres’ (~35 nm) is present. These different categories of nanosized vesicles have different roles inside the human body and it was illustrated that they are implicated in intercellular communication and in the transmission of macromolecules between cells. The exosomes of this study were characterised with ELISA and Western Blot to confirm the presence of exosome markers, including tetraspanin CD63. Nanoparticle Tracking Analysis clearly demonstrated that there is a huge concentration of vesicles of 100 nm derived from cells after treatment with MoS2, in contrast to the exosomes obtained from the control cells which have a large range of different diameters, due to the natural variability. This important result was supported by electron microscopy. IR spectra from each sample were also collected. After prepocessing, principal components analysis was performed to probe the biochemical origin of differences of the exosome populations. The analysis revealed differences in the lipidic but also the proteinic composition, indicating differences in cell signalling of the stressed cells. This study is just a first step to understand the huge amount of reactions that are initiated inside the cells after the treatment with this nanomaterial, and additional analysis needs to be completed to ensure the safety of it after exposure with human cells. Critically, it highlights the potential importance of exosomal signalling in nanoparticle exposed cells, for the first time.