Riassunto analitico
I funghi si sono dimostrati, da sempre, microorganismi in grado di produrre una vasta gamma di composti bioattivi. Spesso considerati potenziali patogeni, essi si sono scoperti prendere parte al nostro microbioma in condizioni fisiologiche e patologiche, definendo una loro nicchia biologica: il micobioma. In ambito chimico-farmaceutico risulta molto interessante individuare nuove molecole con potenziale attività per la comprensione dei meccanismi d’interazione molecolare alla base del micobioma umano. In tale ambito, il presente lavoro sperimentale di tesi di laurea magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, svolto presso l’Università di Ginevra, sotto la supervisione scientifica del Prof. Jean-Luc Wolfender (programma Erasmus+, coordinatore Dott.ssa Federica Pellati), ha avuto come obiettivo l’esplorazione del metaboloma del fungo Epicoccum nigrum, descritto come facente parte del micobioma orale umano, per ricercare e isolare nuovi potenziali composti attivi. La ricerca è stata guidata verso un’approfondita indagine del metaboloma, supportata dalle nuove metodologie a disposizione a livello analitico e dereplicativo, integrando la dereplicazione in-silico MS/MS con il Molecular Networking, al fine di purificare nuovi composti tramite la cromatografia liquida semi-preparativa. Inizialmente, sono state preparate ed estratte colture fungine di Epiccoccum, con l’utilizzo di una miscela di solventi costituita da diclorometano e metanolo. Successivamente, l’estratto è stato sottoposto a estrazione in fase solida (SPE) e quindi è stato analizzato tramite UHPLC-Orbitrap-MS e il profilo ottenuto è stato esaminato mediante il programma MZmine2. Le features ioniche (m/z@RT x Peak Area) dell’intero cromatogramma sono state poi trattate con una procedura di peak picking, al fine di ottenere una lista di ioni presenti nell’estratto, sulla quale è stata realizzata la dereplicazione HRMS1. A sua volta, è stato attuato un metodo derepilcativo innovativo che combina l’utilizzo del Molecular Networking con un database di frammentazione MS/MS in-silico di prodotti naturali. L’unione delle informazioni pervenute dai due metodi dereplicativi ha permesso di individuare nell’estratto di Epicoccum nigrum interessanti features target da isolare, pianificando in modo più mirato le tecniche preparative e analitiche seguenti. È stato quindi analizzato il profilo dell’estratto fungino tramite HPLC per la successiva purificazione. Il metodo HPLC analitico è stato pertanto adattato con l’uso di un transfer geometrico alla cromatografia semi-preparativa. Infine, è stato effettuato il frazionamento dell’estratto e le frazioni ottenute sono state analizzate tramite UHPLC-TOF-MS per individuare quelle contenenti le molecole purificate d’interesse.
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Abstract
Fungi have always been able to produce a wide range of bioactive compounds. Often considered potential pathogens, they have been discovered part of our microbiome in physiological and pathological conditions, defining their biological niche; the mycobiome. However, in the chemical-pharmaceutical field, it is very interesting to identify new molecules with potential activity for understanding the molecular mechanisms of interaction at the base of the human mycobiome.
To take this issue, this experimental work of master's thesis in Chemistry and Pharmaceutical Technology, performed at the University of Geneva, under the scientific supervision of Prof. Jean-Luc Wolfender (Erasmus+ program, coordinator Dr. Federica Pellati), aims to investigate the metabolome of the fungus Epicoccum nigrum described as part of the human oral mycobiome in order to identify, through Molecular Network and MS-based dereplication techniques, potential novel active compounds for furtherly purifying them by Semiprep-LC chromatography. For this, first, an extraction was done on the Epicoccum cultures using a solvent mixture of dichloromethane and methanol. Then, the extract subjected to reversed phase solid-phase extraction (SPE), was profiled by UHPLC-Orbitrap-MS. The LC-MS data matrix was generated using the software MZmine 2. Briefly, all the ion features (m/z@RT x Peak Area) detected in the profiling were deconvoluted using an optimized peak picking procedure for the acquisition of the relevant chromatographic ion traces.
First, they were dereplicated using an HRMS1 approach and then, a dereplication procedure based on the combination of Molecular Networking with an extensive in-silico MS/MS fragmentation database of Natural Products was applied. As a result, interesting putatively new fungal metabolites were identified in a Epicoccum nigrum extract.
For the purification of these molecules of interest, an HPLC analysis of the extract was performed. Then, the analytical gradient was geometrically transferred to the semiprep chromatographic level and a fractionation was performed. Finally, each obtained fraction was analyzed by UHPLC-TOF-MS in order to localize the ones containing purified molecules of interest.
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