Riassunto analitico
L’ipercolesterolemia è una condizione clinica caratterizzata da elevati livelli plasmatici di colesterolo totale e di lipoproteine a bassa densità (LDL), che ne sono le principali trasportatrici.
L’accumulo di colesterolo nei vasi determina un aumento del rischio di patologie cardiovascolari su base aterosclerotica (infarto del miocardio, ictus e vasculopatie periferiche).
L’ipercolesterolemia familiare (FH) è una malattia monogenica autosomica co-dominante causata da mutazioni del gene codificante il recettore delle LDL (LDLR), la proteina di membrana che lega selettivamente le LDL, consentendone l’internalizzazione, il catabolismo intracellulare e quindi la rimozione dal sangue.
Le mutazioni del gene LDLR portano all’espressione di un recettore con funzionalità ridotta o ne impediscono la produzione, determinando un blocco o un diminuito catabolismo intracellulare delle LDL, con conseguente loro accumulo nel sangue.
Le mutazioni possono essere “puntiformi” se coinvolgono un singolo nucleotide, “minute” se interessano un numero limitato di nucleotidi (da qualche unità a qualche decina), mentre sono dette “riarrangiamenti grossolani” quando riguardano regioni abbastanza estese del gene.
In questa tesi sono state identificate cinque diverse mutazioni “minute” del gene LDLR in altrettanti pazienti con ipercolesterolemia familiare eterozigote. Quattro di queste sono risultate non ancora presenti in letteratura.
Non potendo disporre delle cellule dei pazienti per definire l’effetto biologico di queste mutazioni, si è ricorso a strategie in silico basate sull’uso di softwares dedicati.
Tre delle mutazioni interessavano gli esoni: una era una delezione combinata con contemporanea inserzione (di fatto una sostituzione) di 7 nucleotidi nell’esone 11 (già presente in letteratura), mentre le altre due erano semplici delezioni, una nell’esone 2 e l’altra nell’esone 3 che coinvolgevano rispettivamente 7 e 10 nucleotidi. La delezione/inserzione comportava la sostituzione di 3 amminoacidi a livello del dominio di omologia con il precursore dell’EGF del LDLR. L’analisi in silico indica che queste tre sostituzioni amminoacidiche in sequenza sono deleterie per la funzione della proteina recettoriale. Le due delezioni provocano uno scorrimento della trama di lettura a livello dell’mRNA che porta alla formazione di un codone di terminazione prematuro. I probabili prodotti di traduzione di questi mRNA sono proteine tronche non funzionali e velocemente degradate a causa delle loro ridotte dimensioni.
L’analisi in silico ha anche indicato che queste mutazioni esoniche possono determinare effetti sullo splicing (anche se non coinvolgono direttamente i siti principali), in quanto possono indurre il rafforzamento di siti criptici preesistenti oppure la modifica di sequenze di riconoscimento per proteine ausiliarie del processo di splicing.
Le altre due mutazioni interessavano gli introni: una era una delezione di 16 nucleotidi localizzata alla giunzione esone 15/introne 15, l’altra era una delezione/inserzione di 4/8 nucleotidi localizzata nella porzione intronica immediatamente a valle dell’esone 16.
Lo studio in silico ha rivelato che queste mutazioni, abolendo i siti canonici di splicing, portano alla possibile attivazione di altri siti che possono indurre processi di splicing alternativi. Da questi si originerebbero mRNA anomali, con variabili conseguenze sul prodotto di traduzione.
È molto importante determinare se una mutazione genomica è causativa e quale sia il meccanismo genetico-molecolare alla base del suo effetto biologico per poter stabilire una correlazione tra il fenotipo patologico osservato e il genotipo. A questo scopo risulta utile, in mancanza di saggi biologici appropriati, avvalersi di softwares di predizione, che sono in grado di fornire una possibile interpretazione dei meccanismi patogenetici della mutazione in esame.
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