Riassunto analitico
La cartilagine e l’osso possono degenerare a causa di patologie o traumi. Se questi coinvolgono anche tessuti articolari, il danno è definito difetto osteocondrale.
Il problema principale è rappresentato dall’incapacità della cartilagine di autorigenerare, poiché non è né vascolarizzata né innervata e non può accedere alle normali vie di guarigione della ferita.
Nel campo della chirurgia riparativa, le terapie consistono nel trattamento artroscopico con debridement, abrasione artoplastica e microfrattura che stimolano il processo riparativo inducendo la migrazione di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo verso la lesione. Tuttavia, si forma fibrocartilagine con debole resistenza all’usura e rigidità ridotta che quindi non può sopportare carichi fisiologici nel lungo termine. Per superare queste limitazioni l’applicazione dei principi di ingegneria tissutale ha mostrato un grande potenziale.
Attualmente la ricerca sulle cellule staminali è particolarmente focalizzata su fonti alternative di cellule caratterizzate da facile accessibilità e basso impatto nelle procedure chirurgiche. Le BMSCs (cellule staminali del midollo osseo) presentano queste caratteristiche evitando i problemi etici correlati all’uso di cellule staminali embrionali.
Il mio lavoro di tesi valuta il potenziale impiego di cellule staminali mesenchimali, estratte dal midollo osseo (BMSCs), coltivate e differenziate all’interno di scaffolds 3D costituiti da biomateriali per la rigenerazione tessutale dei difetti osteocondrali.
Inizialmente si è verificata la capacità delle BMSCs di differenziare in senso osteogenico o condrogenico. Le cellule sono state coltivate per 21 giorni sia in sistemi bidimensionali (vetrini e piastre Petri) che tridimensionali (pellets e scaffolds 3D). In quest’ultimo caso sono stati usati supporti diversi a seconda del differenziamento: pellets di alginato per il differenziamento condrogenico e scaffolds 3D di collagene e fibroina per l’osteogenico. Trascorse le 3 settimane sono state condotte analisi di immunofluorescenza, western blot e colorazioni istologiche (alcian blu, alizarina-red e ematossilina-eosina) mirate a valutare la presenza di proteine e marker specifici, che permettessero in questo modo di verificare il grado di differenziamento raggiunto. Per il differenziamento condrogenico, tramite analisi di immunofluorescenza, è stata valutata la presenza di SOX9, aggrecano, collagene II e X. La presenza di collagene II e SOX9 è confermata inoltre dal risultato del western blot. Dalla colorazione con Alcian Blu si rileva la presenza di glicosaminoglicani, essenziali nella componente amorfa cartilaginea.
Per il differenziamento osteogenico si è presa in considerazione la presenza di osteocalcina, osteopontina, RUNX 2 e osterix confermata dai risultati dell’analisi di immunofluorescenza e per gli ultimi tre markers anche dal western blot. Si è ricercata anche la presenza di depositi di calcio confermata da colorazione con Alizarina Red.
Avendo ottenuto dei risultati incoraggianti, si è proceduto quindi con l’assemblaggio di scaffolds misti, collagene-alginato e fibroina-alginato, sui quali è stato condotto un differenziamento combinato (osteogenico-condrogenico), utilizzando un medium di coltura costituito ad hoc con determinati fattori di crescita. Dopo 14 giorni si sono effettuate delle nuove analisi, valutando la capacità delle cellule di continuare il differenziamento raggiunto sino a quel momento e non de-differenziare nonostante le nuove condizioni di coltura.
Sulla base dei risultati ottenuti si è potuto valutare quali siano le condizioni e i supporti migliori che permettono la crescita e il differenziamento cellulare e la possibilità di condurre un differenziamento combinato per facilitare lo sviluppo di tessuti complessi, al fine di ricostruire considerevoli volumi in difetti osteo-cartilaginei.
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