Riassunto analitico
Le cellule staminali della polpa dentale (hDPSCs), di derivazione neuroectodermica, possiedono numerose proprietà, quali plasticità, alto tasso di proliferazione, bassa immunogenicità e la capacità di differenziare in diversi lineages cellulari.
I metodi non invasivi di isolamento delle hDPSCs e l’assenza di problemi etici, le rende una preziosa fonte di cellule staminali per la riparazione e la rigenerazione dei tessuti.
Le hDPSCs presentano inoltre importanti proprietà immunomodulatorie che permettono loro di indurre l’apoptosi nelle cellule T attivate. Infatti, studi precedenti hanno permesso di dimostrare il coinvolgimento dei pathway Fas/FasL e PD-1/PD-L1, nei processi di immunomodulazione mediati dalle hDPSCs. I risultati dimostrano una up-regolazione di PD-L1 in hDPSCs poste a contatto, sia esso diretto che indiretto con cellule mononucleate isolate dal sangue periferico (PBMCs) attivate.
Il mio progetto di tesi si è focalizzato sul ruolo dell’up-regolazione di PD-L1 nelle hDPSCs in seguito alla co-coltura con le PBMCs, anche tramite l’aggiunta di uno specifico inibitore di PD-L1. La co-coltura diretta hDPSCs-PBMCs induce un aumento dell’espressione di PD-1 e PD-L1 in entrambe le tipologie cellulari, con conseguente diminuzione dopo l’utilizzo dell’inibitore di PD-L1. Le analisi di citofluorimetria dimostrano come, in seguito alla co-coltura con le hDPSCs, i linfociti CD4+ e CD8+ siano indotti all’apoptosi. Con l’aggiunta dell’inibitore di PD-L1 la percentuale di linfociti apoptotici si riduce, suggerendo che altri pathways ad effetto immunomodulatorio siano attivati. Analisi ulteriori hanno dimostrato gli effetti della co-coltura sul ciclo cellulare delle PBMCs. L’analisi dei livelli di espressione di mRNA delle cicline a diversi tempi sperimentali ha rivelato come le hDPSCs siano in grado di modulare la proliferazione delle PBMCs. E’ interessante osservare come, dopo l’aggiunta dell’inibitore di PD-L1, i livelli di espressione di mRNA delle cicline tornino a valori più simili a quelli del gruppo di controllo (PBMCs coltivate da sole). Parallelamente, analisi di Real-Time PCR sui livelli di mRNA di IL-2 confermano gli effetti delle hDPSCs sul ciclo cellulare, mentre i livelli di mRNA di TNF-a e IFN-g aumentano nelle PBMCs dopo 48 ore di co-coltura con una conseguente diminuzione dopo 72 ore, se paragonate alle PBMCs coltivate da sole. L’aggiunta dell’inibitore di PD-L1 comporta invece una riduzione significativa dei livelli di mRNA di TNF-a e IFN-g, risultando più simili a quelli riscontrati nelle PBMCs coltivate da sole.
Analisi condotte tramite tecnologia MagPix sui surnatanti ottenuti dalle co-colture indirette confermano l’effetto immunomodulatorio delle hDPSCs sulle PBMCs, come dimostrato da un calo significativo del rilascio di TNF-a e IL-2, confermando i dati precedentemente ottenuti.
Parallelamente, lo studio relativo alle hDPSCs ha dimostrato come l’aggiunta dell’inibitore di PD-L1 alla co-coltura diretta induca un aumento dell’espressione di FasL. Questo dato trova conferma nell’aumento dei livelli di mRNA di TNF-a rispetto a quanto osservato dopo la sola co-coltura diretta. Tale evidenza suggerisce quindi che, seppure il pathway PD-1/PD-L1 venga inibito, altri meccanismi immunomodulatori siano innescati dalle hDPSCs. Infatti, la proliferazione cellulare delle hDPSCs nelle varie condizioni sperimentali non risulta alterata, come si evince dall’espressione della PCNA.
I dati ottenuti pongono le basi per ulteriori studi mirati a caratterizzare le proprietà immunomodulatorie delle hDPSCs per lo sviluppo di eventuali trattamenti alternativi per le patologie autoimmuni.
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