Riassunto analitico
Le proteine chinasi fanno parte della famiglia delle chinasi e sono responsabili della fosforilazione delle proteine, uno dei principali meccanismi di regolazione cellulare. Una sua alterazione può portare allo sviluppo di numerose patologie tra cui tumori, ipertensione, malattie infiammatorie ed autoimmuni. Nel mio lavoro di tesi mi sono focalizzato sullo studio del dominio chinasico del recettore transmembrana EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Questa proteina concorre, assieme ad altri fattori, alla progressione del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Questa tipologia di carcinoma si è rivelata essere invasiva ed aggressiva, portando ad esito fatale in tempi rapidi. Tra le terapie attualmente in uso sono presenti inibitori delle chinasi che hanno come bersaglio EGFR. Tuttavia, il rapido insorgere di resistenza da parte delle cellule tumorali, in particolar modo quando questi farmaci sono somministrati in monoterapia, ne rappresenta una grave limitazione. È stato osservato come questo fenomeno sia dovuto allo sviluppo di mutazioni puntiformi nel recettore EGFR, dove le più frequenti sono L858R e T790M. Queste mutazioni portano allo sviluppo di resistenza aumentando l’affinità di legame tra recettore e ATP o attivando costitutivamente il recettore anche in assenza di fattori di crescita. La progettazione e sviluppo di inibitori allosterici di EGFR, cioè molecole in grado di legarsi ad una tasca allosterica in prossimità del sito di legame dell’ATP, può fornire molecole biologicamente attive dotate di maggiore selettività rispetto agli inibitori ATP-competitivi. Inoltre, esse sono potenzialmente meno soggette a fenomeni di farmaco-resistenza. Il mio lavoro di tesi è stato incentrato sull’identificazione di nuovi inibitori allosterici selettivi per le forme mutate T790M e/o T790M/L858R di EGFR. Questa ricerca è stata effettuata tramite studi di virtual screening, utilizzando varie strutture cristallografiche del dominio chinasico di EGFR e ampi database (circa 2.5 milioni di molecole) di composti commercialmente disponibili. Il virtual screening è stato effettuato utilizzando un protocollo di docking molecolare tramite il software Glide. Ho utilizzato come riferimento la recente struttura cristallografica di EGFR in complesso con il ligando allosterico EAI001(PDB code: 5d41). Dopo un’iniziale procedura di messa a punto del protocollo di docking sono state inserite nello studio altre strutture cristalline di EGFR di nostro interesse (PDB code: 3w2r, 2rgp e 3w32). I composti sono stati filtrati sulla base del parametro docking score e delle interazioni di legame. I composti più promettenti sono stati oggetto di un’analisi più approfondita dei complessi ligando-proteina utilizzando il programma BEAR, sviluppato all’interno del laboratorio dove ho svolto il mio progetto di tesi. Questa procedura permette di calcolare con maggiore precisione le energie di legame di questi complessi. Tutti i composti oggetto di studio sono stati valutati sia su strutture wild-type, in presenza e in assenza di ATP, che su strutture cristallografiche con mutazioni T790M e T790M/L858R per prevedere in silico la potenziale selettività verso le forme mutate. I composti sono stati filtrati incrociando i dati ottenuti dalle diverse procedure e successivamente analizzati visivamente. Per facilitare l’analisi visiva dei complessi ligando-proteina, i ligandi sono stati raggruppati in base alla struttura chimica 2D dello scaffold tramite l’utilizzo del software Canvas. Ogni gruppo è stato poi approfonditamente analizzato per selezionare i composti più promettenti e rappresentativi. Al termine del mio lavoro di tesi sono stati selezionati 14 composti per essere acquistati e sottoposti a di studi biologici di attività mediante test in vitro.
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Abstract
Protein kinases are part of the large kinase family and are responsible for protein phosphorylation. Protein phosphorylation is one of the major mechanisms of cellular regulation, and its alteration can lead to the development of many pathologies including tumors, hypertension, inflammatory and autoimmune diseases.
The focus of my thesis work was the study of the kinase domain of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). This protein contributes, along with other factors, to the progression of non-small cell lung cancer (NSCLC). This type of cancer is very invasive and aggressive, leading to a quickly fatal outcome shortly after diagnosis (8-12 months).
EGFR inhibitors are currently available in the clinic.. However, the rapid onset of resistance by tumor cells, particularly when these drugs are administered as monotherapy, represents a major limitation. It has been observed that this phenomenon is due to the development of point mutations in the EGFR receptor, where the most frequent are L858R (leucine to arginine) and T790M (threonine to methionine). These mutations lead to drug resistance by significantly increasing the binding affinity for ATP or by activating the receptor even in the absence of growth factors.
Research and development of allosteric inhibitors (molecules that bind to an allosteric pocket close to the ATP binding site) of EGFR can potentially provide biologically active compounds with higher selectivity compared to ATP-competitive inhibitors. These compounds are also less susceptible to drug resistance. My thesis work focused on identifying new allosteric inhibitors selective for mutated forms T790M and/or T790M/L858R of EGFR.
This research was carried out through virtual screening studies, using several crystallographic structures of the kinase domain of EGFR and large databases (about 2.5 million molecules) of commercially available compounds. Virtual screening was performed using a molecular docking protocol trough Glide software.
I used as a reference the recent crystallographic structure of EGFR in complex with the allosteric ligand EAI001 (PDB code: 5d41). After an initial docking protocol setup procedure, other EGFR crystal structures carrying mutations of our interest (PDB code: 3w2r, 2rgp and 3w32) were included in the study.
The compounds were filtered based on the docking score parameter and binding interactions. The most promising compounds were subjected to a more thorough analysis of the ligand-protein complexes using the BEAR program developed within the laboratory where I did my thesis project. This procedure allows to calculate more accurately the binding energies of these complexes.
All the studied compounds were evaluated on wild-type structures, either with or without ATP, and on crystallographic structure with mutations T790M and T790M/L858R to predict their potential selectivity towards the mutant forms.
The compounds were filtered by cross-referencing the data obtained from the various procedures and then visually analyzed. To facilitate visual inspection of the ligand-protein complexes, ligands were grouped according to the 2D chemical scaffold structure using the Canvas software. Each group was then thoroughly analyzed to select the most promising and representative compounds.
At the end of my thesis work, 14 compounds were selected to be purchased and submitted to in-vitro biological evaluation.
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