• Cocaina
• DAT
• Farmacocinetica
• LC-MS/MS
• Microdialisi

La dopamina (DA) come neurotrasmettitore svolge una grande varietà di ruoli all’interno del sistema nervoso centrale, dalla locomozione alle funzioni cognitive e alla ricompensa psicologica. I livelli di DA nel cervello sono regolati attraverso il suo metabolismo e neurotrasportatori quali DAT e NET. Disfunzioni nei circuiti dopaminergici hanno un ruolo fondamentale in patologie neurologiche come la schizofrenia e la dipendenza da sostanze stupefacenti, la seconda legata in particolare ai livelli di DA nel sistema mesolimbico. Droghe come la cocaina influenzano principalmente il sistema dopaminergico attraverso l’alterazione dell’attività del DAT, bloccando il re-uptake della DA ed aumentando la sua concentrazione extracellulare. Il ripetuto ed eccessivo aumento di dopamina in aree come quelle del sistema mesolimbico è considerato uno dei meccanismi che porta all’instaurazione della dipendenza.
A differenza della cocaina, la Vanoxerina, un altro inibitore del DAT, è considerata atipica nel suo meccanismo, ed il motivo è da ricercarsi nel ridotto aumento di DA e di stimolazione centrale che si riscontra dopo inibizione del trasportatore rispetto alla cocaina. La sua sperimentazione clinica è stata tuttavia interrotta in fase II a causa di una marcata cardiotossicità, precludendone il possibile utilizzo per il trattamento della dipendenza.
Con l’obiettivo di trovare molecole alternative da usare come inibitori potenti e più sicuri del DAT, è stata sintetizzata una serie di analoghi rigidi della Vanoxerina. I composti sono poi stati testati in vitro mostrando in diversi casi una affinità a livello nanomolare ed una alta selettività per DAT. Test in vivo hanno poi dimostrato come il DAhLI6, il migliore dei composti sintetizzati, riducesse la locomozione nei topi e contemporaneamente contrastasse gli effetti stimolanti della cocaina.
Sulla base di questi dati, il mio progetto di tesi ha riguardato lo studio della farmacologia del DAhLI6 attraverso analisi di farmacocinetica e microdialisi. Il DAhLI6 è stato somministrato per via i.p. ad una dose di 40 mg/kg di DAhLI6 ad una batteria di topi, dopodiché sono stati prelevati cervello e plasma a sei diversi time-point, addizionati dello standard interno, omogeneizzati/deproteinizzati ed estratti in fase solida(SPE) con colonna C-18. Gli estratti sono poi stati analizzati attraverso HPLC in fase inversa accoppiato ad un triplo quadrupolo con ionizzazione ESI positiva e modalità MRM. I risultati mostrano un rapporto tra AUC di cervello e plasma di circa 5, confermando come il DAhLI sia in grado di attraversare la barriera ematoencefalica e di raggiungere il compartimento cerebrale.
Con l’obiettivo di studiarne l’influenza sull’attività chimica cerebrale, sono stati condotti esperimenti di microdialisi cerebrale. Sono stati analizzati i livelli di dopamina nei perfusati cerebrali dopo somministrazione di DAhLI6 e/o cocaina, questo attraverso cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa(LC-MS/MS). I dati di microdialisi hanno mostrato come la somministrazione i.p di una dose di 40mg/kg di DAhLI6 non solo non portasse ad un aumento di DA a livello dello strato ma, nel caso di co-somministrazione con cocaina, ne riducesse l’aumento rispetto alla sola somministrazione della droga. Presi insieme questi risultati suggeriscono un potenziale effetto terapeutico dell’inibitore del DAT presentato qui per il trattamento dell’abuso di cocaina.

Dopamine (DA) as a neurotransmitter occupies a wide variety of roles within the nervous system, ranging from motor functions to superior functions such as cognition and reward. Levels of DA in the brain are regulated through its metabolism and neurotransporters like DAT and NET. DA disfunctions have a predominant role in different neurological conditions such as psychosis and drug addiction, the latter being linked to DA’s levels in the mesolimbic system. Drugs such as cocaine mainly affect the dopaminergic system by altering the activity of DAT, blocking DA reuptake, and increasing its extracellular concentration. This repeated and excessive increase in DA activity in areas such as the mesolimbic system is considered one of the mechanisms that leads to the instauration of addiction. Unlike cocaine, Vanoxerine is considered an atypical inhibitor of DAT, with the reason being that, after administration and DAT inhibition, it causes lower DA accumulation and reduced central stimulation compared to cocaine. However, in phase II clinical trials, Vanoxerine showed high cardiotoxicity, a side effect which precluded its use in therapy for the treatment of addiction. In the search for potent and safer DAT inhibitors, a series of constrained analogues of Vanoxerine were synthesized. The compounds were then tested in vitro showing low nanomolar affinity and high selectivity for DAT. In vivo results in mice showed that the best compound, DAhLI6, reduces novelty-induced locomotor activity and counteracts cocaine stimulating effects. Based on these data, my thesis project was to elucidate the pharmacology of DAhLI 6 throughout pharmacokinetic and microdialysis studies. DAhLI 6 was administered i.p. in mice, at a dose of 40mg/kg. Mouse brain and plasma were collected at six time points, added with the internal standard, then homogenized/ deproteinized and extracted using solid phase extraction (SPE) on a C-18 column. The extracts were analyzed using reverse phase HPLC coupled to a triple quadrupole in ESI positive and multiple reaction monitoring mode. The results showed a brain/blood AUC ratio around 5, confirming that DAhLI6 can cross the blood brain barrier and reach the brain compartment. To shed light on DAhLI6's neurochemical activity, cerebral microdialysis experiments were performed. Perfusate levels of DA were detected by using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) after administration of DAhLI6 or/and cocaine. Microdialysis analysis revealed that, unlike cocaine, the administration of DAhLI6 at 40 mg/kg didn’t increase the release of DA from the striatum. In addition, when co-administered with cocaine, DAhLI6 was able to counteract its effects, lowering the DA levels after treatment. Taken together these results suggest the therapeutic-like potential of the presented DAT inhibitor for the treatment of cocaine abuse.