Riassunto analitico
Lo scopo di questo studio è ottimizzare un metodo di microincapsulazione attraverso un approccio statistico chiamato design of experiments (DOE). Il metodo scelto per produrre microcapsule è la reazione di transacilazione che avviene in emulsione acqua/olio fra propilene glicole alginato (PGA) e albumina sierica umana (HSA).
Questa reazione porta alla formazione di un legame ammidico fra il gruppo estereo del PGA e il gruppo amminico libero dell’HSA dopo aver reso l’ambiente di reazione alcalino. Alla fine, si ottengono microcapsule biodegradabili, stabili e biocompatibili che possono essere utilizzate per il rilascio di diverse sostanze in differenti ambiti.
Il protocollo standard seguito per la reazione di transacilazione fra PGA e HSA è il seguente: per prima cosa si prepara la fase acquosa solubilizzando 0,3 g di PGA (grado di esterificazione: 84%) in 8,7 ml di acqua deionizzata e successivamente si aggiungono 1 g di HSA liofilizzata. A questo punto 6 ml della fase acquosa vengono aggiunti alla fase organica di Span® 85 in un tubo montato sopra ad un agitatore meccanico a 1500 rpm in modo che si formi l’emulsione acqua/olio. Dopo cinque minuti, 4 ml di una soluzione di 2% (w/V) NaOH/EtOH (95% (V/V)) vengono aggiunti per far partire la reazione e l’agitazione è mantenuta per ulteriori 15 minuti.
Per fermare la reazione, si aggiungono 150 ml di una soluzione tampone contenente imidazolo (0,05 M, pH=7) e dopo due minuti si interrompe l’agitazione. Le microcapsule così ottenute vengono separate dall’ambiente di reazione mediante sedimentazione e infine lavate con una soluzione acquosa di polisorbato 2% (w/V) (Tween 20, Acros-Organics).
Il processo di ottimizzazione è stato condotto attraverso il design of experiments, in particolare in questo studio ci si è concentrati sull’ottimizzazione della resa di reazione e della distribuzione granulometrica delle microcapsule.
Il design of experiments è un approccio statistico volto all’ottimizzazione di reazioni e processi, che trova impiego in diversi ambiti quali ricerca, sviluppo e produzione. In generale è una procedura consente di valutare un numero elevato di parametri di reazione effettuando un numero ridotto di esperimenti. Verranno discussi diversi approcci possibili, e nel nostro caso specifico viene utilizzato l’approccio 2k fattoriale di progettazione, in modo da studiare tutte le interazioni tra i vari fattori.
Le variabili principali (fattori) sono state scelte dopo diversi studi dell'intero processo di reazione e sono: il volume di NaOH, la velocità di agitazione, la natura della fase organica, la quantità del tensioattivo (Span® 85) nella fase organica e il rapporto tra Span ® 85 e Span®
Oltre a questi fattori, dobbiamo valutare anche le cosiddette risposte, ovvero i risultati degli esperimenti che sono: il diametro medio delle microcapsule, l'intervallo della distribuzione e il rendimento della reazione.
Queste informazioni vengono raccolte dopo ogni esperimento e dopo aver completato tutti gli esperimenti, i dati ottenuti vengono analizzati attraverso il design of experiments.
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Abstract
The aim of this study is to optimize a microencapsulation method using a transacylation reaction in emulsion to produce microcapsules made of covalently linked propylene glycol alginate (PGA) and human serum albumin (HSA).
This technique involves the formation of an amide bond between the free amine function of HSA and the ester group of PGA in an w/o emulsion after alkalinization. In the end we obtained biocompatible, stable and biodegradable microcapsules that are potentially used for drug delivery in different fields such pharmaceutical or cosmetic.
The standard procedure established for the transacylation reaction between PGA and HSA is the following: first, the aqueous solution is prepared dissolving 0,3 g of PGA (84% esterification degree) in water and then adding 1 g of freeze dried HSA. Then 6 ml of the aqueous solution newly formed are added to an organic phase of Span ® 85 in a tube and the stirrer was set at 1500 rpm. After five minutes, 4 ml of 2% (w/V) NaOH/EtOH (95% (V/V)) solution were added to the emulsion in order to trigger the transacylation reaction and stirring was maintained for further 15 minutes. To stop the reaction, 150 ml of imidazole buffer (0,05 M, pH = 7) were added and the agitation was continued for two minutes.
Last, microcapsules are separated through sedimentation and washed with a 2% (w/V) polysorbate aqueous solution (Tween 20, Acros-Organics).
The optimization process was supposed to be conducted thanks to design of experiments, in order to optimize granulometric distribution and yield of reaction.
Design of experiments (DOE) is statistical process used in different fields as research, development and production to optimize a reaction process. This procedure allows us to establish few variables that can be changed, whereas all others are held constant since generically a process might be influenced by different factors. For this study the approach utilized is 2k factorial design in order to study all the interactions between factors
The main variables are set after several studies of the whole reaction process and they are: the volume of NaOH, the speed of agitation, the nature of the oil phase, the quantity of the surfactant (Span 85) in the oil phase and the ratio between Span ® 85 and Span 20 ®. Apart from variables, we have to evaluate also responses, which are the mean of the particles size, the span of the distribution and the yield of the reaction; all of these responses are collected after each experiment. Once all the data are collected, we analyze them through design of experiments.
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