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La Timidilato Sintasi umana (hTS) è un enzima omodimerico coinvolto nella sintesi del DNA tramite la metilazione riduttiva della 2’-deossiuridina-5’-monofosfato (dUMP) in dTMP tramite l’utilizzo di un cosubstrato, N5,N10-metilenetetraidrofolato (mTHF). hTS rappresenta un target importante nel tumore ovarico e del colon-retto. hTS mostra diverse isoforme, come la forma attiva ed inattiva, quella dimerica e monomerica.
È stato osservato che l’inibizione di hTS è in grado di indurre la morte cellulare attraverso l’apoptosi, che viene sfruttato in chemioterapia. I farmaci antitumorali comunemente usati come 5-FU e raltitrexed provocano farmaco resistenza nelle cellule a causa di una sovra espressione dell’enzima. I dimer disrupters (DDIS) sono una nuova classe di inibitori che sono stati studiati per evitare questo meccanismo di farmaco resistenza. DDIS sono in grado di interagire con la forma attiva dell’enzima (forma dimerica), spostando l’equilibrio verso la forma inattiva monomerica. L’analisi dell’efficienza di FRET e le mutazioni a singolo nucleotide che determinano modifiche a livello dell’interfaccia dell’enzima rappresentano le evidenze sperimentali che spiegano lo spostamento dell’equilibrio. Se i DDIS interagiscono con questi residui o nell’area vicina all’interfaccia, una mutazione di questo tipo può influenzare il meccanismo di legame, permettendoci di rilevare questo effetto.
Lo scopo del mio progetto è di comprendere come WT ed i due mutanti selezionati (Q62R e Y202A) possano influenzare il legame dei DDIS; se le mutazioni sono coinvolte nel meccanismo di inibizione e se gli esperimenti di mutagenesi possano validare il meccanismo dissociativo di questi inibitori. Per raggiungere questo obiettivo, ho sviluppato queste attività: ì. Purificazione e caratterizzazione di hTS WT e dei mutanti all’interfaccia Q62R e Y202A usando GE ÄKTA Prime FPLC. Sono stata in grado di determinare la kcat e la KM degli enzimi verso i substrati dUMP e il co-substrato mTHF. ìì. Ho selezionato un set di 8 DDIS composti per esplorare il modo di legame all’interfaccia verso hTS WT ed i due mutanti. I saggi di inibizione (full Ki) sono stati eseguiti verso AIC-A015, AIC-A016, AIC-A028, AIC-A040, LC-1249, LC-1296, LC-1306, E7 in una piastra multipozzetto allo spettrofotometro MultiskanGO a concentrazioni crescenti di mTHF e di inibitore. ììì. Ho eseguito un’analisi dell’efficienza di FRET verso WT e mutanti. iv. Gli studi di docking sono stati eseguiti sui composti ed infine l’analisi dei dati è stata eseguita per distinguere i DDIS dagli inibitori classici. I risultati ottenuti mostrano come gli inibitori abbiano un meccanismo di tipo non-competitivo (misto), legandosi in una tasca allosterica, ovvero all’interfaccia. Le molecole hanno simili Ki su WT e sui mutanti con alcune eccezioni. Le Ki ottenute sono comparabili con quelle ottenute da esperimenti precedenti sugli stessi inibitori, dove il dato di Ki era stato solo calcolato. I dati ottenuti dai saggi di FRET mostrano una significativa diminuzione del segnale dipendentemente dalla concentrazione dei DDIS. Combinando i risultati degli esperimenti di FRET e gli studi di docking, oltre che i valori di Ki, si osserva come tutti gli inibitori abbiano un effetto dissociativo eccetto uno (AIC-A015). Infine, le relazioni struttura attività degli inibitori nel sito di legame sono state esplorate tramite studi di docking molecolari. Meccanismi di legame preferiti sono stati identificati per gli inibitori e collegati agli scaffold dei composti per solo un composto.
In conclusione, l’unico modo per individuare il meccanismo dissociativo dei composti è la diminuzione del segnale di FRET. Tuttavia, alcune possibili interferenze con i segnali di FRET osservati ed i valori di Ki possono sorgere dalla presenza delle mutazioni all’interfaccia. L’effetto delle specifiche mutazioni potrà essere analizzato meglio in studi futuri.

Human Thymidylate Synthase (hTS) is an homodimer enzyme involved in DNA synthesis by the reductive methylation of 2’-deoxyuridine 5’-monophosphate (dUMP) in dTMP using N5,N10-methylenetetrahydro-folate (mTHF) as co-substrate. hTS is an important target in ovarian and colorectal cancer. hTS shows different isoforms such as active and inactive form, dimeric and monomeric forms. It has been observed that hTS inhibition is able to induce cell death through apoptosis, which is exploited in chemotherapy. Commonly used anticancer drugs like 5-FU and raltitrexed cause drug resistance in cells due to an overexpression of the enzyme, a mechanism to overcome the drug effect. Dimer disrupters (DDIS) are a new class of inhibitors that have been studied to avoid this drug resistance mechanism. DDIS are able to interact with the active form of the enzyme (dimeric form), shifting the equilibrium to its inactive monomeric form. The analysis of the efficiency of FRET and of the single point mutation that can be insert at the interface of the enzyme represent the experimental evidences that explain the equilibrium shift. If the DDIS interact specifically with those residues or in the neighbour interface area, a point mutation should affect the compounds binding and this effect should be detectable. The aim of my project is to understand how WT and two selected mutants at the protein interface (Q62R and Y202A) can affect the binding of the dimer disrupters; if the point mutations are involved in the inhibition mechanism and if the mutagenesis experiment can validate the dissociation mechanism. To achieve the described objectives, I developed the following activities: ì. purification and characterization of WT and its interface mutants Q62R and Y202A using GE ÄKTA Prime FPLC. I was able to determine the kcat and KM of the enzymes versus substrate dUMP and co-substrate mTHF. ìì. I selected a set of 8 DDIS compounds to explore their interface binding against WT and the two mutants. The inhibition assays (full Ki) were performed on AIC-A015, AIC-A016, AIC-A028, AIC-A040, LC-1249, LC-1296, LC-1306, E7 in a 96 wells plate at the spectrophotometer MultiskanGO at five increasing given concentrations of mTHF and six increasing concentrations of inhibitor. ììì. I performed a FRET analysis versus the WT and the mutants. iv. Docking studies were performed on the compounds and finally data analysis was performed to distinguish DDIS from classical active-site inhibitors. The results obtained represent the compounds as non-competitive (mixed) inhibitors, which means that they bind in an allosteric pocket, the interface. The studied molecules have similar Ki on the WT and on the mutants with a few exceptions. The Ki obtained are comparable with those measured in former experiments on the same inhibitors, from which the values of Ki were only calculated. FRET data show a significant decrease of the signal depending on the DDIS concentration. Combining FRET experiments results and docking studies other than Ki data suggest that all compounds behave as DDIS with one exception (AIC-A015). Finally, structure activity relationship of the inhibitors inside the binding site were explored using molecular docking studies (Schrödinger Maestro). Preferred binding modes for the selected inhibitors were identified and linked to the compounds scaffold for one compound only. The most part of the compounds show a multiple binding mode at the protein interface. We concluded that the only experiments and indicator of the dissociative inhibition mechanism is the FRET signal decrease. However, some possible interference with the observed FRET signals and Ki value determination may arise from the presence of the point mutation at the interface. The specific mutation effect can be better analysed in future studies together with additional point mutations.