Riassunto analitico
La presente Tesi Sperimentale di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stata realizzata nell’ambito del programma Erasmus+ tra il Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia e la Facoltà di Farmacia dell’Università CEU San Pablo di Madrid (coordinatore Prof. Federica Pellati). L’attività sperimentale della seguente ricerca è stata svolta presso i laboratori del “Center for Metabolomics and Bioanalysis” (CEMBIO), sotto la supervisione scientifica dei Proff. Coral Barbas e Javier Francisco Ruperez.
Il fingerprinting metabolico di tessuti biologici rappresenta oggi un’importante area di ricerca, specialmente nel campo della scoperta di nuovi biomarkers. Sebbene la RP-HPLC-MS sia attualmente una delle principali tecniche analitiche impiagate in ambito metabolomico, essa presenta ancora alcune limitazioni, sopratutto per quanto riguarda l’analisi di metaboliti altamente polari presenti nei fluidi biologici. Inoltre, la notevole variabilità fisico-chimica dei composti analizzati richiede l’uso di tecniche combinate, aumentando i tempi e i costi dell’analisi. Insieme a questo, la quantità di fluidi biologici disponibili per le analisi è spesso limitata.
La presenti tesi è stata finalizzata alla realizzazione e allo sviluppo di un metodo analitico, denominato “HILIC IVDE lower phase”, allo scopo di ridurre la variabilità analitica, i tempi e i costi di analisi, nonché incrementare le informazioni ottenute da piccoli campioni biologici. La validazione del metodo è stata eseguita analizzando 10 campioni di plasma mediante tecnica HPLC-ESI-QTOF-MS, in due condizioni diverse di polarità e a due valori di pH, al fine di ottenere un fingerprinting completo, attraverso la caratterizzazione di tutti i metaboliti presenti nel plasma.
Nel presente studio l’attenzione si è poi focalizzata sulla steatosi epatica non alcolica (NAFLD), disturbo epatico cronico in aumento in tutto il mondo. Una dieta carente di metionina e colina (MCD) rappresenta un modello di NAFLD nei topi. Tuttavia, il meccanismo con cui questa dieta contribuisce allo sviluppo della patologia risulta tutt’oggi non completamente compreso.
In particolare, il metodo HILIC IVDE lower phase, sviluppato nella presente ricerca, è stato applicato a 7 campioni di tessuto di fegato, di cui 4 ottenuti da topi MCD e 3 da topi di controllo, con l’obiettivo di identificare metaboliti chiave implicati in alterazioni indotte dalla dieta MCD e migliorare le conoscenze relative al meccanismo patologico alla base della NAFLD. I dati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi chemiometrica, che ha permesso di ottenere una validazione dell’intera procedura e di individuare differenze significative tra i due gruppi (CHOW e MCD), attraverso la costruzione di modelli statistici come PCA. L’analisi statistica univariata e multivariata ha inoltre consentito di definire i composti realmente significativi, che sono stati quindi potenzialmente identificati mediante la ricerca della massa accurata di ogni singolo metabolita, tramite differenti database online.
La maggior parte dei metaboliti sono stati determinati in una sola condizione analitica e solamente 9 sono stati rilevati in almeno due condizioni. Inoltre, il maggior numero di composti identificati risulta essere presente in entrambi i gruppi. I metaboliti potenzialmente identificati appartengono a diverse classi chimiche e tra queste i lipidi sono risultati essere i più abbondanti.
La studio delle variazione tra i due gruppi e la valutazione dell’entità dei cambiamenti ha permesso di chiarire alcune alterazioni metaboliche indotte dalla dieta MCD, che è legata alla progressione della NAFLD nei topi trattati, oltre che a migliore le conoscenze relative alla patogenesi della malattia nel uomo.
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