Riassunto analitico
La microfluidica è una tecnica emergente che offre numerose possibilità per la creazione di nanoparticelle uniformi, monodisperse e facilmente scalabili attraverso l’uso di chip che possono presentare diverse strutture al loro interno. In particolare, questa tecnologia ha recentemente dimostrato grandi potenzialità nella produzione di liposomi che sono stati usati nella produzione dei vaccini per il COVID 19.
In questo studio sono state formulate ed ottimizzate tre diverse tipologie di liposomi attraverso la tecnica della microfluidica per studiare l’incapsulazione di un peptide neuroprotettivo, usato come farmaco modello. I tre diversi tipi di liposomi sono stati: 1) liposomi neutri di dipalmitoilfosfaditilcolina (DPPC) e colesterolo (Chol); 2) liposomi cationici di DPPC, Chol e il lipide cationico 1,2-dioleil-3-trimetilammonio propano (DOTAP); 3) liposomi anionici di DPPC, Chol e il lipide anionico 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfaditilglicerolo (POPG).
Inizialmente è stato ottimizzato il protocollo formulativo per la produzione dei liposomi neutri, variando i parametri di composizione lipidica e della tecnica della microfluidica, come per esempio il rapporto molare tra i lipidi e il flow rate ratio (FRR, 1:1, 1:0.5, 1:0.3). Il volume della formulazione finale, il total flow rate, la concentrazione teorica massima dei liposomi, e il solvente organico usato sono stati mantenuti costanti. Dopo aver definito che la composizione con maggiore stabilità corrispondesse al rapporto molare di 1:1 per DPPC-Chol, i lipidi anionici e cationici sono stati aggiunti nella formulazione per ottenere liposomi con superficie carica negativamente o positivamente.
L’effetto dell’aggiunta di diverse quantità di lipidi carichi e dell’uso di diversi FRR è stato valutato tramite analisi chimico-fisiche. Tutte le formulazioni sono state caratterizzate usando la Photon Correlation Spectroscopy per determinare il diametro, l’indice di polidispersione (PDI) e la carica superficiale (potenziale zeta), mentre la morfologia dei liposomi è stata determinata usando il microscopio a forza atomica. Inoltre, la stabilità dei liposomi a diverse condizioni di conservazione (congelamento a -20°C o in frigorifero a 4°C) è stata valutata.
Cinque formulazioni liposomiali sono state selezionate sulla base della loro stabilità e delle caratteristiche chimico-fisiche per incapsulare il peptide. L’efficienza di incapsulazione è stata valutata attraverso analisi HPLC, andando a valutare come la presenza di lipidi carichi possa influenzare l’incorporazione del farmaco.
In futuro le formulazioni più promettenti verranno testate su modelli di topi per la degenerazione della retina per determinare l’efficacia e l’attività dei liposomi caricati con il peptide. Nel complesso, queste ottimizzazioni aiuteranno a creare liposomi stabili e scalabili che possano migliorare l’incapsulamento, la protezione e delivery di una varietà di peptidi terapeutici.
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Abstract
Microfluidics is an emerging technological field which offers the possibility to create uniform, monodispersed, and easily scalable nanoparticles using chips with different architectures (eg. circular or zig zag). In particular, this technology has recently demonstrated great potential in the production of liposomes which were used for the mass production of the COVID 19 vaccine.
In this study, the formulation of three different types of liposomes was optimized utilizing a microfluidic device to improve the encapsulation of a neuroprotective peptide that was used as a model drug. The different liposomes were: 1) neutral liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and cholesterol (Chol); 2) cationic liposomes of DPPC, Chol and the cationic lipid 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP); and 3) anionic liposomes consisting of DPPC, Chol and the anionic lipid 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol (POPG).
First, the formulative protocol of neutral liposomes was optimized by varying factors linked to the lipidic composition and the microfluidic technique, such as the molar ratio between the lipids, and flow rate ratios (FRR, 1:1, 1:0.5, 1:0.3).. The final formulation volume, total flow rate, maximum theoretical liposome concentration, and the organic solvent used were kept constant. After assessing the composition that led to the most stable formulation, which corresponded to a 1:1 DPPC:Chol molar ratio, the cationic and anionic lipids were added to obtain positively or negatively charged liposomes, and the effects of different molar ratios between lipids and FRR were investigated. All formulations of liposomes were characterized using photon correlation spectroscopy to determine their size, polydispersity (PDI), and surface charge (Zeta-potential), while the morphology of the liposomes was determined using Atomic Force Microscopy. Furthermore, liposome stability under different storage conditions (freezing at -20°C, or liquid storage at +4°C) was investigated.
Five liposomal formulations were selected based on their stability and chemico-physical characteristics to encapsulate the peptide. Encapsulation efficiency was evaluated via HPLC analysis for each formulation, demonstrating how the presence of charged lipids in the liposome matrix can influence the incorporation of a drug. In the future, the most promising optimized formulations will be tested in a mouse model of retinal degeneration to assess the efficacy and activity of liposomes loaded with this neuroprotective peptide. Overall, these optimizations will help create stable and scalable liposomes that can improve the encapsulation, protection, and delivery of a variety of therapeutic peptides.
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