Riassunto analitico
La ricerca nel campo della nanomedicina offre molte tecnologie promettenti per il trattamento di patologie difficili da trattare e prive di terapie efficaci. Le nanoparticelle (NPs) preparate con il copolimero poli(lattico-co-glicolico) (PLGA), approvato dall’FDA, offrono diversi vantaggi, tra cui il controllo sulle caratteristiche chimico-fisiche, sulla biodistribuzione, un miglioramento nella veicolazione e rilascio dei farmaci e la possibilità di direzionamento verso le sole cellule malate. Nello sviluppo delle nanoparticelle, è importante ottimizzare il protocollo di formulazione per ottenere caratteristiche desiderabili in termini di dimensioni, carica superficiale, omogeneità, morfologia, quantità residua di tensioattivo e stabilità allo stoccaggio, in modo da sfruttarne appieno le proprietà e per garantirne un utilizzo sicuro. Caratteristica peculiare delle nanoparticelle di PLGA è la possibilità di modificare la superficie con ligandi specifici per il direzionamento a specifici organi o cellule. Questo è un aspetto cruciale, poiché riduce il rischio di tossicità aspecifica e facilita il direzionamento specifico verso il target. Tra le applicazioni delle NPs, una interessante è il direzionamento al Glioblastoma Multiforme. Il Glioblastoma Multiforme (GBM) è un tumore che affligge principalmente la popolazione maschile > 55 anni, ma anche una piccola parte della popolazione più giovane può risentire di questa patologia. La difficoltà principale che si riscontra nel trattamento di GBM è che i suoi sintomi si manifestano solo nell’ultimo stadio della patologia e i trattamenti approvati, tra i quali chirurgia, chemioterapia e radioterapia, non sono efficienti. Per queste ragioni, le nanoparticelle di PLGA opportunamente ingegnerizzate possono rappresentare un’opportunità concreta per migliorare l’approccio terapeutico verso GBM. Lo scopo di questa tesi è stato diviso in due step: 1) ottimizzazione delle caratteristiche chimico-fisiche delle NPs di PLGA, della loro composizione e stabilità; 2) modificazione della superficie delle NPs ottimizzate con ligandi specifici per il GBM (peptide g7, peptide AAV-F e due anticorpi monoclonali contro Vimentina di superficie). Per quanto riguarda il primo obiettivo, le formulazioni delle NPs sono state ottimizzate variando la quantità di CY5, fluoroforo utilizzato per rendere tracciabili le NPs nei saggi in vitro e in vivo, la percentuale di Pluronic® F68 utilizzato nella formulazione e nella soluzione di risospensione, e la procedura di purificazione in modo da recuperare una maggiore percentuale di prodotto. Riguardo al secondo proposito della tesi, il protocollo di post-modificazione è stato ottimizzato modificando diverse variabili, tra cui la concentrazione della soluzione di MES utilizzata, la concentrazione di ligandi aggiunta, e la procedura di purificazione attraverso la centrifugazione. Per confermare l’ottimizzazione delle NPs coniugate ai ligandi, queste sono state caratterizzare nelle dimensioni, carica superficiale e omogeneità grazie all’analisi di PCS; inoltre, è stata testata la loro stabilità a condizioni differenti di conservazione (a 4°C, a -20°C e dopo liofilizzazione). Tutte le ottimizzazioni eseguite assicurano la riproducibilità, l’omogeneità e la stabilità delle nanoparticelle formulate. In più, grazie alla collaborazione con i laboratori di Neurobiologia cellulare e Neuro-Nanotecnologia di Limerick, le nanoparticelle modificate con i ligandi in superficie sono state studiate per conoscere la loro capacità di entrare selettivamente nelle cellule GBM e non negli astrociti sani. Le prospettive future di questo lavoro includono maggiori studi sull’efficienza dei ligandi scelti e sulla loro selettività verso le cellule GBM, puntando verso il miglioramento della prognosi della patologia.
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Abstract
Nanomedicine research offers promising technology for hard-to-treat diseases. In particular, nanoparticles (NP) prepared with the FDA approved copolymer poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) offer some advantages including controlled physico-chemical characteristics, biodistribution, improved drug delivery, and targeting possibilities.
In the NP formulation process, it is important to optimize the formulation protocol in order to obtain NPs with desirable characteristics such as size, Z potential, size distribution, morphology, the residual amount of surfactants, and stability to take advantage of their properties for their safe use.
A peculiarity of PLGA NPs is the possibility to modify their surface with specific ligands that can promote organ or cell-specific delivery. This is important to reduce non-specific toxicity and increase delivery to the target cells. Among the NPs applications, an interesting one is Glioblastoma Multiforme targeting.
Glioblastoma Multiforme is a tumour affecting especially male patients over 55 years but also a small part of the younger population suffers from this disease. The principal difficulty of GBM is that the symptoms occur in the late stage of the disease, and the treatments with surgical approach, chemotherapy and radiotherapy aren’t effective. For these reasons, well-characterized PLGA nanomedicines are a great option for improved GBM delivery.
The purpose of this thesis is divided into two steps: 1) the optimization of the physico-chemical properties of PLGA nanoparticles, composition, and stability and 2) surface modification of the optimized NPs with GBM specific ligands (g7 peptide, AAV-F peptide, and Cell Surface Vimentin antibodies).
For the first purpose, the NP formulations were optimized varying the amount of CY5, a fluorophore used to make the NPs visible during in vitro and in vivo imaging; the percentage of Pluronic ®F68 used in the formulation and in the resuspension solution; and evaluated the purification procedure.
Regarding the second aim of the thesis, the post-modification protocol was optimized considering several factors, among which the concentration of MES solution used for the post-modification; the amount of ligands added in the post-modification; and the purification procedure by centrifugation. To confirm the optimization of the surface-modified NPs, these were characterized in size, Z potential and homogeneity by PCS analysis; furthermore, their stability at different storage conditions (at 4°C, at -20°C, and after lyophilization) were tested. All this optimization will ensure reproducibility, homogeneity and stable NP formulations with surface modification with each of the four chosen GBM targeting ligands.
Additionally, thanks to the collaboration with the Cellular Neurobiology and Neuro-Nanotechnology laboratories of Limerick, the targeted NPs were tested for their ability to be uptaken and selectively enter GBM cells over non-GBM astrocytes.
The future perspectives of this work include more studies to investigate the efficiency of the ligands chosen and their selectiveness for GBM cells, pointing towards ameliorating the prognosis of this disease.
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