• doxorubicin
• edelfosine
• interactions
• lipid-nanoparticles
• osteosarcoma

L’Osteosarcoma (OS) è il tumore osseo più frequente in età pediatrica. L’assenza di sintomi evidenti e specifici e il suo alto grado di metastatizzazione, soprattutto polmonare, sono gli aspetti che convertono OS in una delle malattie più letali per bambini e adolescenti.
Gli attuali protocolli terapeutici per OS prevedono una chemioterapia neo-adiuvante, seguita da una rimozione chirurgica e una sessione chemioterapica post-operatoria. Fin dalla loro introduzione negli anni Ottanta per pazienti con OS locale, questi nuovi protocolli hanno incrementato la percentuale di sopravvivenza, nonostante nei pazienti con metastasi continui a essere bassa.
La Doxorubicina (DOX) è uno dei farmaci di prima linea nel trattamento dell’OS; tuttavia, le alte dosi richieste e la cardiotossicità rappresentano i principali limiti al suo uso clinico. Edelfosina (ET) è un alchilfosfolipide che ha precedentemente mostrato risultati promettenti in vitro contro una gran varietà di tumori. Ciò nonostante, gli effetti secondari sono numerosi, come un elevato potenziale emolitico e una bassa biodisponibilità. La nanomedicina offre utili strategie che permettono di ottimizzare queste terapie: i nanosistemi possono veicolare il farmaco direttamente a un organo o tessuto specifico ridurre gli effetti secondari o le tossicità sistemiche delle terapie, ed evitare lo sviluppo delle resistenze multiple, grazie a un uso di dosi inferiori di farmaco.
In base a queste considerazioni, l’obiettivo generale di questo progetto è stato la valutazione di strategie alternative per il trattamento dell’OS basate sulla nanomedicina. Per questo scopo, ET e DOX sono state incapsulate in nanoparticelle lipidiche, di cui è stata verificata l’efficacia in vitro. Sono state, inoltre, condotte analisi ex vivo per verificare tale efficacia.
Le nanoparticelle lipidiche di ET e DOX (ET-LN e DOX-LN rispettivamente) sono state preparate attraverso il metodo dell’omogeneizzazione a caldo, ottimizzato in precedenti studi. Si sono ottenute nanoparticelle di dimensioni inferiori a 150 nm, con un PDI minore di 0.25 e valori negativi di potenziale zeta. Queste caratteristiche hanno confermato la loro adeguatezza per la somministrazione in vivo. L’efficacia in vitro dei farmaci è stata studiata con saggi di citotossicità MTS. I risultati hanno mostrato un incremento nell’efficacia dei farmaci incapsulati, con un IC₅₀ minore rispetto alla forma libera. Inoltre, è stato studiato l’effetto sull’uptake di ET nel caso di somministrazione combinata di DOX con ET o con ET-LN. Nelle cellule pre-trattate con DOX è stata osservata una ridotta internalizzazione di ET libera e incapsulata. Infine, l’efficacia ex vivo dei farmaci è stata valutata attraverso saggi di immunocolorazione con antigene Ki-67 su modelli murini di OS. Questa analisi ha dimostrato che i gruppi di ratti trattati con ET ed ET-LN presentavano una minor quantità di cellule proliferanti tumorali nelle tibie, rispetto agli animali non trattati o a cui erano stati somministrati Farmiblastina® libera (DOX commerciale) e la sua combinazione con ET.
I risultati ottenuti da questo studio suggeriscono una notevole efficacia contro le cellule di OS dei farmaci ET e DOX incapsulati; tuttavia, la combinazione di DOX con ET o ET-LN, alle dosi utilizzate, non ha implementato l’efficacia del trattamento.

Osteosarcoma (OS) is the most common bone tumour affecting paediatric patients. Its lack of evident and specific symptoms and its high ability to metastasize, mainly to the lungs, are two aspects that make OS one of the most lethal diseases for children and adolescents. Current protocols for OS therapy consist of neoadjuvant chemotherapy, followed by a surgical removal of the tumour tissue and a post-operative phase of chemotherapy. Since their introduction in 1980s for patients with localized OS, these new protocols have increased the survival rates, but patients with metastases still have a poor prognosis. Doxorubicin (DOX) is one of the main drugs used for the treatment of OS; however, the high dosage required and its cardiotoxicity set major limitations on its clinical use. Edelfosine (ET) is an alkylphospholipid that has previously shown in vitro promising results against a wide variety of tumours. Nevertheless, it presents severe systemic side effects, such as high haemolytic potential and poor bioavailability. Nanomedicine offers useful strategies that can successfully allow optimization of these therapies: nanocarriers can target drugs directly towards a specific tissue or organ in the body, reduce side effects or systemic toxicities of the therapies, and avoid the development of multidrug resistance, not least because lower doses of actives can be used. Within this context, the general objective of this project was to evaluate the efficacy of alternative treatment strategies for OS using nanomedicine. To that end, first ET and DOX were encapsulated into lipid nanoparticles (LN) and their efficacy was evaluated in vitro. Ex-vivo analysis of the drug’s efficacy was also performed. LN of ET and DOX were prepared through a previously optimized hot homogenization technique. The nanoparticles produced with this technique presented a mean size smaller than 150 nm, PDI values less than 0.25 and negative zeta potential values. These characteristics confirmed their suitability for in vivo administration. The in vitro efficacy of the drugs was studied by MTS viability assays. The results showed the improved efficacy of the encapsulated drugs, with a lower IC50 than the free forms. Furthermore, the effect of the combined administration of DOX and ET on the ET uptake was also studied. A decrease in the uptake of ET and ET-LNs was observed when cells were pre-treated with DOX. Finally, the ex-vivo efficacy of the drugs was evaluated through the immunostaining of OS murine tibiae. The Ki-67 immunohistochemical staining revealed that tibiae treated with ET and ET-LNs presented fewer proliferating tumour cells in comparison to untreated mice or to those groups treated with free Farmiblastina® (commercial DOX), or with its combination with ET-LN. The results obtained from this study suggest that the encapsulated forms of ET and DOX have powerful activity against OS cells; however, the combination of DOX with ET or ET-LNs, at the doses studied, does not increase the treatment efficacy.