Riassunto analitico
Lo sviluppo di metodi in vitro alternativi a quelli in vivo per studiare l’assorbimento percutaneo di molecole bioattive rappresenta una sfida alla quale i ricercatori sono chiamati con l’obiettivo di eliminare o ridurre i test farmacologici e tossicologici eseguiti sui modelli animali. Nell’ambito dell’assorbimento percutaneo, l’Organizzazione Mondiale della Sanità e l’Organizzazione per la Cooperazione e lo Sviluppo Economico suggeriscono un test in vitro non ancora validato dal Centro Europeo per la Validazione dei Metodi Alternativi che consiste nella diffusione di sostanze chimiche attraverso espianti di cute animale. Questa tecnica, tuttavia, potrebbe generare difficoltà di approvvigionamento degli espianti, considerazioni etiche sfavorevoli e risultati sovrastimati rispetto a quelli ottenuti in vivo. Pertanto, è auspicato e incoraggiato lo sviluppo di metodi alternativi in vitro. In precedenti ricerche eseguite presso il laboratorio di Drug Delivery and Targeting afferente al Dipartimento di Scienze della Vita, sono stati realizzati e valutati modelli di strato corneo (SC) ottenuti dall’attività gelificante di molecole lipofile (acido stearico, SA; tristearina, TS) o anfifiliche (sorbitan tristearato, STS) in grado di incorporare un fluido lipidico fisiologico (squalene) e generare un network capace di simulare la struttura intercellulare dello SC responsabile della funzione barriera della cute. La valutazione dei dati di permeazione cutanea in vitro confrontati con quelli ottenuti in vivo ed ex-vivo ha evidenziato una buona correlazione vitro/vivo e vitro/ex vivo per i modelli costituiti dal 20% di TS e da STS indipendentemente dalla sua concentrazione e dalla presenza o meno di acqua. La presente ricerca si è posta come obiettivo quello di esaminare la microstruttura dei modelli di SC realizzati in precedenza, adottando un approccio multi-analitico e interdisciplinare al fine di ottenere informazioni dettagliate riguardanti l’organizzazione microstrutturale dei gelificanti e trovare parametri-chiave predittivi della permeazione cutanea. Considerando che le proprietà strutturali di lipogeli (o organogeli) si estendono da una scala molecolare ad una macroscopica, sono state impiegate diverse tecniche strumentali. Sono stati preparati otto modelli di SC, sia binari (lipogeli) che ternari (micoemulsioni) a due diverse concentrazioni di gelificante, già valutati in termini di assorbimento percutaneo di butilmetossidibenzoilmetano e blu di metilene, selezionati come esempi, rispettivamente, di sostanze lipofile e idrofile. Mediante “inverted test tube” e determinazione dell’entità del fenomeno di sineresi, è stato verificato lo stato fisico di ogni modello in termini di avvenuta gelificazione e capacità di immobilizzazione della fase lipofila. Lo studio della microstruttura dei modelli è stato eseguito mediante microscopia a luce polarizzata e a scansione elettronica, analisi termiche quali Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) e Termogravimetria/Analisi Termica Differenziale (TG/DTA), spettrofotometria FTIR, Diffrattometria dei Raggi X (XRPD) e analisi reologiche. A differenza del processo di gelificazione e dalla concentrazione di gelificante, che appaiono come condizioni irrilevanti nella simulazione dello SC, i parametri-chiave predittivi della permeazione cutanea sono legati alla conformazione, all’arrangiamento del gelificante e alla presenza di fasi cristalline
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Abstract
The development of in vitro methods to predict in vivo percutaneous absorption of bioactive molecules is a challenge to which the researchers are called in order to eliminate or reduce the pharmacological and toxicological tests on animal models. In the percutaneous absorption context, the World Health Organization and the Organization for Cooperation and Economic Development recommended an in vitro test, not yet validated by the European Centre for Validation of Alternative Methods, which involves the diffusion of chemicals through explants of human or animal skin, a technique that could, however, generate difficulties of procurement as well as ethical considerations. Moreover, animal skin is referred to overestimate the in vivo permeation. Therefore, the development of alternative in vitro models replacing the use of excised skin is encouraged.
Previous unpublished research carried out at the Delivery and Targeting laboratory (Department of Life Sciences) involved stratum corneum (SC) models obtained by the activity of gelators, lipophilic (stearic acid, SA; tristearin, TS) or amphiphilic (sorbitan tristearate, STS) molecules, embedding a physiological lipid fluid (squalene) to provide networks capable of simulating the intercellular structure of SC, as the main barrier against the transport through the skin. The evaluation of in vitro skin permeation data compared with ex-vivo and in vivo results showed good vitro/ex vivo and vitro/vivo correlations by using SC models consisting of 20% TS, and STS regardless of concentration and water embedding.
The present research has planned to investigate the microstructure of the SC models by the adoption of a multi-analytical and interdisciplinary approach to provide detailed understanding about the gelator behaviour and organization within the models and find possible parameters playing a key-role in SC permeation prediction. By considering that lipogel (or organogel) structural properties extend from the molecular to macroscopic scale, several techniques can be adopted. Eight SC models were produced consisting of binary (lipogels) or ternary (microemulsions) mixtures, at two different organogelator concentrations, for skin permeation assessment of butyl methoxydibenzoylmethane and methylene blue as the chemical compound models for lipophilic and hydrophilic substances, respectively. Each SC model was investigated for physical state in terms of gelation occurring and oil-binding capacity by the “inverted tube test” method and syneresis measurement, respectively. The assessment of SC microtexture was carried out by using polarized light microscopy, Environmental Scanning Electron Microscopy, thermal analyses (DSC and TG/DTA), Fourier Transform Infra-Red spectroscopy, X-Ray Powder Diffraction, and rheology tests. Unlike gel formation and gelator concentration, that appeared as negligible conditions to achieve the best SC simulation, conformation and arrangement of gelator fibers as well crystallinity phases were found to play a fundamental role in skin permeation prediction.
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