Riassunto analitico
Lo sviluppo dei farmaci è ispirato dalla necessità di nuove terapie per le neglected disease o dalla necessità di limitare le interazioni tra farmaci e gli effetti collaterali migliorando la qualità di vita del paziente. Validato un target correlato alla patogenesi della malattia, l’identificazione di tasche adatte allo sviluppo di farmaci è necessario per l’identificazione di composti hit. Nella ricerca sul cancro un interesse crescente è stato sviluppato nei confronti dell’Hippo pathway, una via di segnalazione intracellulare chinasica la cui deregolazione è considerata un marker tumorale. Quando attiva, la cascata chinasica determina la fosforilazione di YAP causando la sua ritenzione citoplasmatica e degradazione proteasomiale. Al contrario, quando la via è inattiva, la forma non fosforilata di YAP migra nel nucleo attivando la famiglia di fattori di trascrizione TEAD1-4 portando all’espressione di geni legati alla proliferazione e sopravvivenza cellulare. Per questo motivo, la dissociazione del complesso hTEAD4:YAP rappresenta un obiettivo promettente per lo sviluppo di nuove classi di farmaci antitumorali. Negli ultimi decenni, la formazione del complesso è stata studiata e la struttura cristallina risolta mostra che il dominio C-termine di hTEAD interagisce con la regione N-termine di YAP attraverso 3 interfacce. L’interfaccia 3 di hTEAD4 che interagisce con il motivo omega loop di YAP è stato dimostrato essere cruciale per la stabilità del complesso. La lenta identificazione di composti hit e lead si deve alla necessità di avere una conoscenza più approfondita e saggi per lo studio delle interazioni farmaco-target. Per questo motivo, il nostro laboratorio è stato coinvolto in un progetto di ricerca con lo scopo di sviluppare un nuovo e semplificato saggio per studiare le interazioni hit/lead-target. In questo contesto, lo scopo della mia tesi è consolidare le conoscenze strutturali rispetto hTEAD4 YBD e disegnare saggi esplorativi per lo studio delle interazioni di substrati con ligandi basati sulle interazioni proteina-proteina. Per raggiungere questi obiettivi, ho svolto le seguenti attività: i. ottimizzazione dell’espressione della proteina ricombinante hTEAD4 YBD (aa 217-434) in E.Coli e messa a punto di un protocollo ottimale per la purificazione. ii. ottimizzazione dell’espressione della proteina ricombinante hTEAD4 YBD doppio mutante (aa 217- 434 S222C, E434C) in E.Coli e messa a punto di un protocollo di purificazione. iii. caratterizzazione strutturale della proteina ottenuta mediante dicroismo circolare (CD). iv. coniugazione del doppio mutante hTEAD4 YBD con 5’-tiol-oligonucleotidi 20mer legati a ditiodipiridina (DTDP) per studi con le pinze ottiche. v. disegno di saggi basati sulla fluorescenza per esaminare la dissociazione del complesso hTEAD4:YAP. In conclusione, questo lavoro ha portato all’ottimizzazione del protocollo di espressione e purificazione delle proteine ricombinanti hTEAD4 YBD wild type e mutante nelle cellule E.Coli ArcticExpress con una resa di 20mg/L di coltura cellulare. La loro corretta sequenza è stata confermata mediante analisi LC/MS mentre la struttura secondaria è stato analizzata attraverso CD. Il doppio mutante è stato coniugato con successo agli oligonucleotidi attivati per gli studi con le pinze ottiche, i quali mirano alla identificazione di tasche dinamiche, ma l’osservazione della formazione del complesso è da ottimizzare. Inoltre, un saggio basato sul FRET e sull’anisotropia di fluorescenza è stato disegnato e sono stati raccolti risultati preliminari che dimostrano la formazione del complesso fra hTEAD4 YBD e 15aa peptide simile a YAP. Tuttavia, permane la necessità di un’ulteriore ottimizzazione e la validazione mediante un controllo positivo.
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Abstract
The Drug Discovery process is inspired by the necessity of therapeutics for neglected diseases, or the need to limit drug interactions and side effects improving patience’s quality of life.
Once a target is validated as involved in the disease progression, the identification of a druggable pocket is required to proceed with hits identification.
In cancer research there has been a growing interest towards Hippo Pathway, an intracellular kinase signalling pathway whose deregulation is considered a cancer hallmark.
When active, the kinase cascade determines the phosphorylation of YAP (Yes-associated protein), causing its cytoplasmatic retention and proteasome degradation. Conversely, when the pathway is inactive, the non-phosphorylated form of YAP migrates into the nucleus binding, thus activating, the transcriptional enhanced associated domain (TEAD1-4) transcription factors leading to the expression of cell survival and proliferation related genes.
For this reason, the disruption of hTEAD4:YAP complex represents a promising target for a novel class of anticancer drugs.
In the last decades, the complex formation has been investigated and the crystal structure solved showing that the C-terminal YBD of hTEAD interacts with the N-terminal region of YAP via three interfaces. The interface 3 of hTEAD4 interacting with the Ω-loop motif of YAP has been demonstrated to be crucial for the complex stability.
A lack of knowledge about deep understanding of structural features and assays to study drug:target interactions are at the basis of a slow hit and lead identification achievement. Therefore, our laboratory was involved in a research project with the aim of developing novel and simplified assays to detect hit/lead drug target interactions.
In this context, the aim of my thesis was to consolidate the structural knowledge about TEAD YBD and to set-up exploratory assays to study its interactions with substrates and PPI ligands.
To reach these objectives I developed the following activities:
i. optimization of the expression of recombinant hTEAD4 YBD (aa 217- 434) protein in E.Coli and set up of an optimal purification protocol.
ii. optimization of the expression of recombinant hTEAD4 YBD double mutant (aa 217- 434 S222C, E434C) protein in E.Coli and set up of an optimal purification protocol.
iii. structural characterization of the obtained protein with circular dichroism (CD).
iv. double mutant hTEAD4 YBD conjugation with 5’-thiololigonucleotides 20mer coupled with dithiodipyridine (DTDP) for optical tweezer studies.
v. design of fluorescence-based assay to examine disruption of hTEAD4 YBD:YAP complex.
In conclusion, this work has led to the optimization of a protocol to express and purify the recombinant hTEAD4 YBD wild type and double mutant in E.Coli ArcticExpress cells (yield 20mg/L of cell culture). Its correct sequence was confirmed through LC/MS analysis while the secondary structure was analysed through CD. The double mutant was successfully conjugated with activated oligonucleotide for optical tweezer studies to discover dynamic pockets, however the complex detection is to be optimized. Furthermore, a FRET assay and fluorescence anisotropy assay were designed, and preliminary results have been obtained demonstrating hTEAD4 YBD and a 15aa YAP-like peptide complex formation. However, they need to be further optimized and validated with a positive control.
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