• Blood-Brain-Barrier
• Doxorubicin
• Glioblastoma
• PNPs
• SPIONs

Il Glioblastoma Multiforme (GBM) è uno dei più comuni e aggressivi tra i tumori cerebrali primari. Esso rappresenta circa il 15,4% di tutti i tumori cerebrali primari e il 60-75% degli astrocitomi. La mortalità associata al GBM è superiore al 90% a 5 anni dalla sua diagnosi, con una sopravvivenza media di soli 12,6 mesi. Questo è legato alle specifiche caratteristiche del GBM: crescita veloce e aggressiva; infiltrazione rapida e tentacolare del tessuto nervoso centrale circostante; sviluppo di radio- e chemio-resistenza; stimolazione del processo di neo-vascolarizzazione (neo-angiogenesi). Ad oggi, i trattamenti, che includono chirurgia, radio- e chemio-terapia, non sono efficaci nel distruggere il tumore o nel prevenire la sua ricomparsa.
Una delle opzioni recentemente proposte per superare questi problemi è sfruttare la nanotecnologia: l’idea è quella di racchiudere il farmaco antineoplastico all’interno di nano-carriers o nano-trasportatori, che dovrebbero portare l’agente attivo solo al sito bersaglio, eliminando gli effetti collaterali dovuti all’interazione del farmaco con i tessuti non target. Questi veicoli inoltre dovrebbero migliorare il passaggio del farmaco attraverso la barriera ematoencefalica (BEE) e consentirne il rilascio e un duraturo accumulo all’interno del SNC.
Gli obiettivi di questo progetto sono: 1) formulare e ottimizzare Nano Particelle Polimeriche (PNPs) a scopo teranostico; 2) valutare l’efficacia della Doxorubicina (DOX) incapsulata su differenti linee cellulari del GBM e studiare la sicurezza del nano-trasportatore; 3) investigare l’abilità delle PNPs di attraversare la BEE.
Le PNPs sono formate da acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) e contengono Doxorubicina (DOX) come agente antineoplastico e SPION come agente diagnostico. Le PNPs sono state formulate con il metodo della singola emulsione. Di esse sono stati determinati la dimensione, il potenziale zeta e l’indice di poli-dispersione (PDI); in più è stata misurata la quantità di alcol poli-vinilico (PVA), DOX e SPION effettivamente incapsulati.
Le PNPs devono avere una dimensione inferiore ai 200 nm per attraversare la BEE. Per raggiungere questo obiettivo sono stati modificati diversi parametri -come il tempo di sonicazione o la percentuale dei surfattanti-, ma nessuna delle variazioni del protocollo già in uso ha dato luogo alla produzione di particelle con dimensioni inferiori ai 200 nm.
Usando poi la migliore formulazione ottenuta (205,9 nm), sono stati svolti studi sull’efficacia delle PNPs su due linee cellulari del GBM: 9L (ratto) e NSC-23 (uomo). Attraverso studi di tossicità del nano-trasportatore, è stata anche testata la sua sicurezza.
La vitalità cellulare, e quindi l’efficacia dei trattamenti, è stata valutata con il saggio del MTS o saggio della proliferazione cellulare.
I risultati hanno mostrato che la DOX incapsulata risulta tossica per le cellule del GBM alle concentrazioni testate, con una IC50 che è circa 5 volte il valore della IC50 della DOX libera per le cellule 9L. La DOX incapsulata, invece, è efficace per le NSC-23 quanto la DOX libera. In entrambi i casi, la somministrazione del solo veicolo (PNPs senza DOX), non interferisce con la vitalità delle cellule.
Una volta dimostrata l’efficacia della formulazione, è stato sperimentato il passaggio delle PNPs attraverso un modello umano di BEE. I risultati hanno mostrato una riduzione del passaggio della DOX libera e un aumento della quantità di farmaco che attraversa il modello umano di BEE quando incapsulato nel nano-trasportatore, indicando che le PNPs migliorano il transito della DOX attraverso la barriera.

Multiforme Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive of the primary brain tumours. It represents about 15,4% of all primary brain tumours and about 60-75% of all astrocytomas. Mortality associated with GBM is greater than 90% 5 years after its diagnosis, with a median survival of 12,6 months. This is linked to the specific characteristics of the GBM: fast and aggressive growth; rapid spread into the central nervous system (CNS); expansion with finger-like tentacles; radio- and chemo-resistance; stimulation of the neo-vascularization process (neoangiogenesis). Up to now, the treatments – which include surgery, radio- and chemo-therapy – have not been effective in destroying the tumour or preventing the recurrent tumour. One of the options recently proposed to overcome these problems involves taking advantage of nanotechnology: the idea is to enclose the anticancer drug in different nanocarriers, that can bring the active agent only to the target, avoiding the side effects due to the action of the drug on non-target tissues. These vehicles should also improve the passage through the blood brain barrier (BBB) and allow drug release and long-lasting accumulation of it in the CNS. The aims of this project are: 1) to develop and optimize Polymeric-based NanoParticles (PNPs) for theranostic purpose; 2) to evaluate the efficacy of the encapsulated DOX on different GBM cell lines and to study the safety of the nanocarriers; 3) to investigate the NPs ability to cross the BBB. PNPs are formed by poly (lactic-co-glycolic acid) and contain Doxorubicin (DOX) as antineoplastic drug and SPION as diagnostic agent. Particles were formulated using the single emulsion method. They are characterized in size, poly-dispersity index (PDI) and zeta-potential; moreover, the amount of poly-vinyl alcohol (PVA), DOX and SPION was measured. For the particles to cross the BBB their size should be under 200 nm. To achieve this objective several parameters were investigated (such as the time of sonication or the percentage of surfactants), but none of the protocol modifications resulted in particles with size lower than 200 nm. Using the best obtained formulation (205,9 nm), efficacy studies were performed on two GBM cell lines: 9L (rat) and NSC-23 (human). The toxicity studies of the free vehicle were also tested. The viability of cells, and therefore the efficacy of the treatments, was assessed with MTS cell proliferation assays. Results showed that the encapsulated DOX is toxic for GBM cells at the concentrations evaluated, with an IC50 that is 5-fold than the IC50 of free DOX for 9L cells. On the other hand, loaded DOX is as effective as free DOX in the human NSC-23 cell line. In the both cases, the administration of the vehicle (PNPs without DOX) does not interfere with the cells viability. Once the effectiveness of the formulation had been demonstrated, the PNPs passage through a human model of the BBB was investigated. Results showed a reduction of the passage of the free DOX and an increase in the amount of drug that passes through the BBB model when encapsulated in the nanocarriers, meaning that PNPs improve the transit of the DOX through the BBB.