Riassunto analitico
La presente Tesi Sperimentale di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stata realizzata nell’ambito del programma Erasmus+ tra il Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia e la Facoltà di Farmacia dell’Università CEU San Pablo di Madrid con la Prof. Federica Pellati nel ruolo di coordinatrice. L’attività di ricerca sperimentale è stata svolta presso i laboratori del “Centro di Eccellenza in Metabolomica e Bioanalisi” (CEMBIO), sotto la supervisione scientifica della Prof. Antonia García e della Dott. Laura Mayo Martinez. Lo scopo della presente ricerca è stato quello di ottimizzare, validare e applicare un nuovo metodo analitico per analizzare acidi grassa a catena corta (quali acido acetico, acido propionico, acido butirrico, acido isobutirrico, acido valerico, acido isovalerico) in campioni di plasma mediante liquido cromatografia accoppiata a spettrometria di massa con triplo quadrupolo come analizzatore (LC-MS/MS). Nella presente ricerca la quantificazione di acidi grassi a catena corta è stata effettuata mediante il metodo dello standard interno. Gli analiti in questione sono composti polari, volatili e a basso peso molecolare, caratterizzati da bassi tempi di ritenzione, scarsa efficienza di ionizzazione e bassa sensibilità nella loro forma originaria. Questo ostacola notevolmente la loro analisi, soprattutto in campioni come il plasma/siero, dove la loro concentrazione è nell'intervallo nM-µM. Pertanto, essi sono difficilmente analizzabili in cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa come tali senza tecniche di derivatizzazione chimica. La dansil idrazina (Dns-Hz) è stata usata come agente derivatizzante, essendo in grado di reagire con gli acidi grassi a catena corta per formare composti stabili caratterizzati da tempi di ritenzione maggiori e migliori efficienza di ionizzazione e sensibilità. Il metodo è stato prima ottimizzato per trovare le condizioni più idonee per la preparazione del campione e per raggiungere condizioni cromatografiche in grado di separare gli analiti, specialmente gli isomeri, con una buona risoluzione e un tempo di analisi ridotto.
Una volta ottimizzato, il metodo è stato validato secondo le linee guida dell’European Medicines Agency (EMA) per dimostrarne riproducibilità e attendibilità, validando parametri quali linearità, accuratezza, precisione, selettività, effetto matrice e stabilità. Una volta validato, il metodo è stato applicato a campioni di siero e plasma per quantificare acidi grassi a catena corta in campioni umani e di roditori, mostrando alcune applicazioni della metodologia proposta.
|
Abstract
This Experimental Thesis for a Master's Degree in Pharmaceutical Chemistry and Technology was carried out within the framework of the Erasmus+ program between the Department of Life Sciences of the University of Modena and Reggio Emilia and the Faculty of Pharmacy of the CEU San Pablo University of Madrid, with Prof. Federica Pellati in the role of coordinator. The experimental research activity was carried out at the laboratories of the 'Centre of Excellence in Metabolomics and Bioanalysis' (CEMBIO), under the scientific supervision of Prof. Antonia García and the PhD student Laura Mayo Martinez. The aim of the present research was to optimize, validate and apply a new analytical method for analyzing short-chain fatty acids (as acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid) in plasma samples by means of liquid chromatography coupled with mass spectrometry with triple quadrupole as analyzer (LC-MS/MS). In the present research, the quantification of short-chain fatty acids was carried out using the internal standard method. The analytes in question are polar, volatile and low molecular weight compounds, characterized by low retention times, poor ionization efficiency and low sensitivity in their native form. This fact extremely hinders their analysis specially in samples such as plasma/serum where their concentration is in the nM-µM range. Therefore, they are difficult to analyze in liquid chromatography coupled to mass spectrometry as such without chemical derivatization techniques. Dansyl hydrazine (Dns-Hz) was used as a derivatizing agent, being able to react with short-chain fatty acids to form stable compounds characterized by longer retention times and better ionization efficiency and sensitivity. The method was first optimized to find the most suitable conditions for sample preparation and to achieve chromatographic conditions capable of separating the analytes, especially isomers, with good resolution and reduced analysis time. Once optimized, the method was validated according to European Medicines Agency (EMA) guidelines to demonstrate reproducibility and reliability, validating parameters such as linearity, accuracy, precision, selectivity, matrix effect and stability. Once validated, the method was applied to serum and plasma samples to quantify short-chain fatty acids in human and rodent samples showing some applications of the proposed methodology.
|
