Riassunto analitico
La presente Tesi Sperimentale di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche è stata realizzata grazie all’accordo di scambio internazionale offerto dal Programma Erasmus+ che il Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia, nella figura della coordinatrice Prof. Federica Pellati, ha stipulato con la Facoltà di Farmacia dell’Università CEU San Pablo di Madrid. L’attività di ricerca sperimentale è stata svolta presso i laboratori del “Center of Excellence in Metabolomics and Bioanalysis” (CEMBIO), sotto la supervisione scientifica della professoressa Antonia Garcia e del dottorando David Chamoso Sanchez. Il presente studio è stato finalizzato alla rivelazione delle modifiche metaboliche avvenute nel pattern lipidico cellulare di cellule di leucemia mieloide acuta e cronica a seguito di un trattamento con cannabidiolo, composto non psicoattivo presente in Cannabis sativa L. che ha mostrato azione antiproliferativa nei confronti di questa tipologia di cellule tumorali, allo scopo di determinare alterazioni significative della membrana cellulare riconducibili all’induzione dell’apoptosi, precedentemente osservata da studi in vitro.
In questo lavoro di tesi sono state prese in esame cellule di leucemia mieloide acuta (HL-60) e cellule di leucemia mieloide cronica (K562). Sono state analizzate a confronto cellule non trattate (controllo) e cellule trattate con cannabidiolo (CBD). Nel caso delle cellule di tipo HL-60 il trattamento è avvenuto con CBD alla concentrazione di 10 µM, mentre nel caso delle cellule di tipo K562 il trattamento è avvenuto con CBD 23 µM. Entrambe le linee cellulari sono state esposte al trattamento con CBD per 48h. L’analisi è stata svolta seguendo tutti i passaggi chiave di un’analisi lipidomica. Dopo la lisi delle cellule, il quenching e l’estrazione dei lipidi, i campioni sono stati analizzati mediante tecnica UHPLC-QTOF-MS. L’analisi è stata effettuata sia in condizione di polarità positiva sia negativa per ottenere un quadro completo del pattern lipidico in cui fossero evidenziate tutte le classi lipidiche, anche quelle visibili in una sola delle due polarità.
I dati così ottenuti sono stati elaborati mediante diversi software che ne hanno permesso la processazione e attraverso i quali sono stati costruiti modelli statistici come PCA, PLS-DA e OPLS-DA, all’interno di questi è stata possibile l’individuazione di variabili significative che hanno garantito la correlazione tra i dati stessi. Lo svolgimento dell’analisi statistica, sia univariata che multivariata, ha permesso la definizione dei composti statisticamente significativi per il modello e questi, una volta filtrati sulla base di valori forniti dai diversi test statistici applicati, sono stati identificati in modo certo con l’ausilio di software basati su database di identificazione specifici. Le assegnazioni incerte di alcuni metaboliti sono state poi confermate attraverso lo studio degli spettri di frammentazione di massa degli stessi.
I metaboliti identificati che sono risultati significativi dal punto di vista statistico appartengono a diverse classi lipidiche, tra le quali i fosfolipidi (tra cui in particolare cardiolipine, fosfatidilcoline, fosfatidilserine e sfingomieline) e i glicerolipidi (tra cui in particolare i trigliceridi), risultano essere le più abbondanti. Queste due classi di composti possiedono un andamento differente per quanto riguarda la loro concentrazione, come si evince dal confronto tra cellule trattate e non trattate.
L’interpretazione biologica dei dati sperimentali ha permesso di evidenziare alcune alterazioni lipidiche importanti legate al trattamento con CBD, plausibilmente connesse con diversi meccanismi metabolici coinvolti nel processo di morte cellulare per apoptosi.
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Abstract
This Experimental Master's Degree Thesis in Pharmaceutical Chemistry and Technology was realized thanks to the international exchange agreement offered by the Erasmus+ Program that the Department of Life Sciences of the University of Modena and Reggio Emilia, in the figure of the coordinator Prof. Federica Pellati, has stipulated with the Faculty of Pharmacy of the CEU San Pablo University of Madrid. The experimental research activity was carried out at the laboratories of the "Center of Excellence in Metabolomics and Bioanalysis" (CEMBIO), under the scientific supervision of Professor Antonia Garcia and the PhD student David Chamoso Sanchez.
The present study was aimed at revealing the metabolic changes that occurred in the cellular lipid pattern of acute and chronic myeloid leukaemia cells following treatment with cannabidiol, a non-psychoactive compound present in Cannabis sativa L. which showed antiproliferative action in these type of cancer cells, to determine significant alterations of the cell membrane attributable to the induction of apoptosis, previously observed from in vitro studies.
In this thesis work, cells of acute myeloid leukaemia (HL-60) and cells of chronic myeloid leukaemia (K562) were studied. Control cell lines, untreated cells treated with cannabidiol (CBD) were compared. In the case of HL-60 cells, treatment was carried out with CBD at a concentration of 10 μM, and 23 µM CBD in the case of K562 cells. Both cell lines were exposed to CBD treatment for 48h. All the steps in the whole lipidomics workflow were performed, including cell lysis, quenching, lipid extraction, sample analysis, data pre-processing, data treatment, statistical analysis and biological interpretation. After extraction of the lipid content, the samples were analysed by UHPLC-QTOF-MS both in positive and negative ionization modes to obtain a complete picture of the lipid profile.
The data thus obtained were pre-processed and treated using different software and after that multivariate (PCA, PLS-DA and OPLS-DA) and univariate statistical analysis allowed us to distinguish significant variables that were identified with different confidence based on specific criteria. The uncertain assignments of some metabolites were then confirmed manually through the study of the mass fragmentation spectra and databases.
The identified metabolites that were statistically significant belong to several lipid classes, among which phospholipids, specially cardiolipins, phosphatidylcholines, phosphatidylserines, sphingomyelins resulted downregulated and glycerolipids, especially triglycerides were upregulated after CBD treatment with higher set of altered compounds in the chronic line. The biological interpretation of the experimental data allowed us to highlight some important lipid alterations related to CBD treatment, plausibly connected with different metabolic mechanisms involved in the process of cell death by apoptosis.
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