Riassunto analitico
I composti appartenenti alla classe dei farmaci biologici sono in continua crescita. Essi sono ottenute mediante tecniche biotecnologiche e sono ampiamente impiegati nel trattamento di diverse patologie gravi e croniche. Lo sviluppo di questi farmaci ha profondamente cambiato il mercato nell’arco degli ultimi anni, acquistando un ruolo centrale tra gli investimenti delle più grandi aziende farmaceutiche. Nello specifico, i farmaci biotecnologici di natura proteica (inclusi peptidi ricombinanti, glicoproteine e anticorpi monoclonali) rappresentano ad oggi la componente predominante delle nuove strategie terapeutiche. L’elevato grado di complessità e variabilità di queste molecole, tuttavia, ne richiede una caratterizzazione completa, rappresentando una sfida significativa dal punto di vista analitico.
Tra le diverse tecniche analitiche impiegate, la cromatografia liquida in fase inversa (reversed-phase liquid chromatography – RPLC) è una di quelle più utilizzate, a causa dell’elevata risoluzione ed efficienza, ulteriormente incrementate dai recenti sviluppi in termini di materiali impiegati e tecnologie di impaccamento delle colonne cromatografiche. Dato il ruolo centrale di questa tecnica separativa nell’analisi delle proteine, è pertanto essenziale possedere una conoscenza accurata dei coefficienti di diffusione molecolare (Dm) di tali biomolecole. Questi valori, infatti, sono necessari per condurre studi sulla performance delle colonne, consentendo il calcolo accurato dei termini inclusi nel modello generale di altezza equivalente di un piatto teorico, il quale a sua volta fornisce informazioni circa il fenomeno di trasferimento di massa, l’allargamento dei picchi cromatografici e l’efficienza separativa in generale.
Viene qui presentato un database di valori di Dm sperimentalmente determinati, in condizioni operative tipiche della cromatografia in fase inversa e con proteine modello di comune impiego. Si è cercato di proporre semplici modelli matematici in grado di dare un buon fitting con i dati sperimentali ottenuti e tali poi da consentire di estrapolare ulteriori valori di coefficienti di diffusione per le suddette molecole in condizioni di lavoro simili (ovvero modificando le percentuali di acqua/acetonitrile nella fase mobile impiegata).
I coefficienti di diffusione molecolare sono stati calcolati con il metodo del capillare aperto di Taylor-Aris, dando dimostrazione della validità del set-up sperimentale utilizzato. I risultati così ottenuti sono quindi stati confrontati con quelli teoricamente previsti dall’equazione di Young, Carroad e Bell. È stato così possibile evidenziare una scarsa coerenza dei valori ricavati applicando quest’ultima formula, specialmente nel momento in cui si trattano biomolecole di grandi dimensioni, date le complesse interazioni che queste generano in condizioni potenzialmente critiche per la loro stabilità.
Il presente lavoro di tesi è basato sul lavoro sperimentale condotto presso il Laboratorio di Analisi Farmaceutica della Katholieke Universiteit di Leuven (supervisor Prof.ssa Deirdre Cabooter), nell’ambito del Programma Erasmus+ (coordinatrice Prof.ssa Federica Pellati).
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Abstract
Nowadays there is an increasing number of substances produced from biological sources through biotechnologies, known as biopharmaceuticals, that are in widespread use for the treatment of different chronic and life-threatening diseases. These therapeutic drugs have been profoundly changing the market during the past few years, gaining a central role among the investments of the larger pharmaceutical companies. In particular, protein biopharmaceuticals (including recombinant peptides, glycoproteins and monoclonal antibodies) currently represent the main contributor to this innovative therapeutic weapon. Their great complexity and variability, however, require a thorough characterization with various techniques, which represents a significant analytical challenge.
Reversed-phase liquid chromatography (RPLC) is a frequently applied technique for proteins analysis, thanks to its high resolution and efficiency, further boosted by the new developments in materials and column packing technologies. Considering the crucial role of this analytical technique, an accurate knowledge of molecular diffusion coefficients (Dm) of large biomolecules is therefore essential. These Dm-values, in fact, are necessary in fundamental column performance studies, allowing the calculation of the terms present in the general plate height model, which in turn describes the mass transfer phenomena and gives information about the peak broadening and the column efficiency in general.
A database of experimentally determined Dm-values of some frequently used model proteins under RP conditions is here presented. An attempt is made to introduce simple mathematical models giving a good fitting to the obtained data, which allow to extrapolate further Dm-values for the investigated molecules under similar working conditions (i.e., for different water/acetonitrile concentrations in the mobile phase).
Diffusion coefficients are measured using the Taylor-Aris open tube method, and the validity of the employed set-up is demonstrated. The values obtained are then compared to the ones theoretically predicted using the Young, Carroad and Bell’s equation. The unsuitability of an estimation made by the literature correlation is in this way highlighted, especially when dealing with large biomolecules and their complex interactions occurring in working conditions that can be potentially critical for their stability.
The current thesis is based on experimental work carried out at the Laboratory of Pharmaceutical Analysis of Katholieke Universiteit Leuven (supervisor Prof. Deirdre Cabooter), as part of the Erasmus+ Program (coordinator Prof. Federica Pellati).
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