Riassunto analitico
Il progetto della presente tesi si è basato sulla comparazione tra l’assorbimento della catechina, flavonoide ampiamente diffuso nella dieta, e della catechina glicoside, corrispondente derivato naturale non disponibile commercialmente, utilizzando l’organismo modello Caenorhabditis elegans. Il glucoside di catechina è stato ottenuto per mezzo di una estrazione che ha previsto la crusca d’orzo (Hordeum vulgar) come matrice vegetale di partenza. Si è pensato di utilizzare il composto estratto come intermedio sintetico per conseguire, attraverso reazioni ossidative, il rispettivo derivato glucuronidico. La catechina glucuronide resta l’unico coniugato metabolico (dei principali flavonoidi antiossidanti studiati) per il quale non si dispone di un metodo adatto per poterlo ottenere. L’obiettivo principale di questa indagine è stato quello di verificare se il glucoside di catechina venisse assorbito meglio della catechina e se fosse sottoposto a deglicosilazione per svolgere il suo effetto. Ciò a conferma di precedenti studi condotti sul glucoside di quercetina, eseguiti dai ricercatori del gruppo del Prof. Celestino Santos-Buelga, Facoltà di Farmacia, Università di Salamanca, dove è stato svolto il presente lavoro di ricerca nell’ambito del programma LLP/Erasmus. E’ stata pianificata l’estrazione, utilizzando la crusca di orzo e le lenticchie come matrice, e metanolo e acetone come solventi. Si è effettuata la caratterizzazione del contenuto flavonoidico della porzione estratta in acetone (75%) di entrambi i vegetali, per mezzo della tecnica HPLC (high performance liquid chromatography) con detector a serie di diodi (DAD) accoppiata a spettrofotometria di massa con sorgente di ionizzazione elettrospray negativa (ESI-MS). E’ stato quindi isolato il glucoside di catechina dall’orzo per mezzo di una separazione in HPLC di tipo semipreparativo. Si sono svolti poi tre tentativi di ossidazione di tale composto, che hanno previsto l’uso di due ossidanti: il reattivo di Jones (cromo triossido in acido solforico diluito) e il reattivo TEMPO (2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-ossido). Dal controllo svolto per mezzo di HPLC-DAD-MS si è potuto individuare il derivato glucuronidico, formatosi però in quantità insufficienti per poter predisporre un isolamento con HPLC di tipo semipreparativo. Si è poi perseguito l’intento iniziale, sottoponendo il glucoside di catechina, estratto dall’orzo, al nematode C. elegans. Il terreno di coltura è stato trattato ad una concentrazione pari a 200 µM del composto in questione, utilizzando la catechina come controllo rispetto al quale valutare l’assorbimento da parte del nematode. Si è osservato che il glucoside di catechina, una volta assorbito da C. elegans, viene sottoposto a processi metabolici che portano alla totale deglicosilazione dello stesso. Infatti non è stato possibile individuare (per mezzo di HPLC-DAD-MS) la molecola di partenza, ma solo l’aglicone corrispondente (catechina) e acidi flavonoidici, formatisi dalla sua rottura. Si è potuto stimare un incremento dell’up-take della catechina pari al 30% nei nematodi trattati con il glucoside rispetto a quelli cresciuti nel terreno preparato con il controllo. In base ai dati ottenuti in questo studio si potrebbe affermare che il glucoside di catechina viene assorbito meglio rispetto al suo aglicone, nel quale viene trasformato una volta introdotto nell’organismo. Si presuppone che l’assorbimento sia migliore perché coinvolge trasportatori attivi come gli SGTL-1 (trasportatori di glucosio sodio dipendenti), ma sono necessarie ulteriori indagini al fine di chiarire i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nell’azione di questo composto. Nell’ipotesi di una eventuale formulazione sarebbe in ogni caso auspicabile prendere in considerazione l’utilizzo del flavonoide legato allo zucchero rispetto alla molecola semplice.
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Abstract
The project of this thesis work is based on the comparison between the absorption of catechin, a flavonoid widely spread in the diet, and its correspondent natural derivative, catechin glycoside, not available commercially, by using the model organism Caenorhabditis elegans. Catechin glucoside was obtained from an extraction where the bran of barley (Hordeum vulgar) was used as vegetable raw material. This extract was even used as a intermediate compound to achieve, through subsequent oxidative reactions, the glucuronide correspondent derivative. Catechin glucuronide is still the only metabolic conjugate (among the main antioxidant flavonoids investigated) without a suitable synthesis method. The main task of this investigation was to understand whether catechin glucoside is absorbed better than catechin itself and if it is subjected to a deglycosylation to carry out its effect. All this to confirm the previous studies on the glucosides of quercetin , that were carried out by the research team of Prof. Celestino Santos-Buelga, Faculty of Pharmacy, University of Salamanca, where this work took place under the LLP/Erasmus project. The extraction was performed by using bran of barley and lentils as matrix, methanol and acetone as solvents. The characterization in flavonoid’s content of the extracted portion in acetone (75%) of both the plants was performed by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) with diode array detector (DAD) coupled to mass spectrophotometry with a source of negative electrospray ionization (ESI-MS). Catechin glucoside was isolated from barley by a semipreparative HPLC . Three attempts to oxidize this compound were performed, with the use of two oxidizers: Jones reagent (solution of chromium trioxide in diluted sulfuric acid) and TEMPO reagent (2,2,6,6-tetrametylpiperidine-1-oxide). The investigation with HPLC-DAD-MS detected the production of glucuronide, but its amount was too little for an eventual isolation trough semipreparative HPLC. Then the initial aim was followed: the catechin glucoside extracted from barley was submitted to C. elegans. The culture medium was treated at a concentration of 200 µM of the mentioned compound, using catechin as a control to evaluate the absorption of the nematode. It was observed that the glucoside of catechin, once absorbed by C. elegans, is subjected to metabolic processes that lead to the total deglycosylation of the compound. It was not possible to find (by HPLC-DAD-MS) the starting molecule, but only the corresponding aglycone (catechin) and flavonoidic acids formed from its breakage. A 30% increase in catechin uptake was determined in nematodes treated with the glycoside than those grown in the ground prepared with control. The data obtained in this study reveals that the glucoside of catechin is absorbed better than its aglycone, in whom it is transformed once introduced into the body. It is believed that this absorption is better because it involves active transporters such as SGTL-1 (sodium dependent glucose transporters), but further investigations are needed to clarify the molecular and cellular mechanisms involved in the action of this compound. In the event of a possible formulation, it would be desirable to consider the use of the flavonoid linked to the sugar with respect to the simple molecule.
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