Riassunto analitico
La formazione del tessuto muscolare scheletrico, ossia la miogenesi, è un processo a tappe nel quale precursori embrionali differenziano e fondono a dare miotubi che infine maturano a fibre muscolari, queste tappe sono controllate da due famiglie di fattori di trascrizione: i determinanti miogenici bHLH (basic Helix-Loop-Helix) e le proteine MEF2 (Myocyte Enhancer Factor-2). Esistono numerosi studi sulla funzione delle proteine MEF2 nelle cellule muscolari in coltura, ma la loro funzione in vivo è ancora oscura. Lo Zebrafish, Danio rerio, si è rivelato, per diverse ragioni, un ottimo animale modello per lo studio della funzione di queste proteine nello sviluppo muscolare. E' stato dimostrato che il Knock-Down di Mef2c e di Mef2d singolarmente, mediante oligonucleotidi antisenso morfolinati, non evidenzia alterazioni muscolari. Il Knock-Down di entrambe le proteine determina, invece, gravi difetti di maturazione muscolare, suggerendo che per la corretta miogenesi sia indispensabile una sinergia fra le proteine Mef2d e Mef2c. A riprova del ruolo svolto da Mef2c e d nella miogenesi, sono stati allestiti esperimenti di “rescue”, nei quali è stata valutata la capacità di Mef2d e Mef2c sovraespressi singolarmente, di correggere i difetti muscolari: è stato osservato che, mentre la sovraespressione di Mef2d nei morfanti ha ripristinato la corretta miogenesi, la proteina Mef2c non ha recuperato pienamente la maturazione muscolare. Per spiegare questo risultato è possibile ipotizzare che negli esperimenti di rescue non sia stata utilizzata l'isoforma proteica necessaria per una corretta miogenesi, dal momento che in Zebrafish esistono due geni paraloghi di MEF2C: mef2ca e mef2cb, i cui trascritti subiscono splicing alternativi che originano diverse isoforme. Nel topo è stato evidenziato che lo splicing alternativo dei trascritti di mef2c è un meccanismo regolatore dell’attività della proteina, sebbene lo stesso non sia stato confermato in Zebrafish, si può ipotizzare che tale meccanismo sia conservato anche in questo vertebrato inferiore. Obiettivo del laboratorio è di individuare la variante proteica di Mef2c che svolge un ruolo centrale nello sviluppo muscolare. Per questo motivo, sono state precedentemente isolate alcune isoforme di splicing della proteina Mef2ca di zebrafish: 4-5-6, 4-6 e 4’-6’. Lo scopo della mia tesi è consistito nell’analisi di tali isoforme, con l’intento di valutare eventuali diverse funzionalità in vivo delle proteine. A tal fine ho valutato i livelli della loro espressione in diversi stadi della miogenesi di zebrafish, tramite esperimenti di RT-PCR e Real-Time PCR, per determinare possibili modulazioni che suggeriscano un ruolo differente durante lo sviluppo di zebrafish. Questi esperimenti hanno evidenziato una diversa espressione delle isoforme durante lo sviluppo, in particolare l'espressione dell'isoforma 4-5-6 è regolata e compare solo a 24 ore di sviluppo, quando inizia il differenziamento muscolare, suggerendo un suo specifico ruolo nella miogenesi. In seguito ho proceduto alla caratterizzazione biochimica delle isoforme, in cellule di mammifero, tramite esperimenti di immunofluorescenza. A livello funzionale ho valutato l’attività transattivante delle isoforme di splicing tramite saggio di transattivazione, indicando una maggiore attività dell’isoforma 4-5-6 rispetto alle altre isoforme. Infine ho valutato la capacità di ciascuna isoforma di sinergizzare con il determinante miogenico MyoD uno dei più importanti coattivatori di MEF2C. I dati ottenuti indicano una maggiore potere transattivante dell’isoforma 4-5-6 a 24h di sviluppo, rispetto alle altre, suggerendo che questa isoforma sia necessaria per una corretta miogenesi durante lo sviluppo di Zebrafish.
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