Riassunto analitico
Nonostante la notevole disponibilità di farmaci antitumorali si ha spesso fallimento terapeutico a causa della tossicità o dei fenomeni di resistenza. È quindi necessario individuare nuovi bersagli terapeutici, parallelamente agli studi su sistemi di veicolazione, per migliorare la risposta al trattamento. In questo contesto, nel mio lavoro di tesi, mi sono occupata di due progetti.A)La Hippo Pathway, via di segnalazione intracellulare, consiste in una cascata chinasica i cui effettori portano al blocco della proliferazione cellulare e alla promozione dell'apoptosi tramite l'inibizione del coattivatore trascrizionale YAP(Yes-Associated Protein). L’isoforma defosforilata di YAP migra nel nucleo dove dimerizza nel complesso YAP-TEAD(Transcriptional enhancer associate domain), responsabile dell’aumento di espressione di geni antiapoptotici. TEAD mostra tre superfici di legame: un sito lipidico a cui si lega l’acido miristico/palmitico, l’interfaccia2 ancora poco studiata e l’interfaccia3 che rappresenta il sito di legame per l’Ω-loop di YAP. Lo sviluppo di molecole che causino l’inibizione dell’associazione YAP-TEAD è di recente interesse farmaceutico nel trattamento di tumori solidi. Ciò è però difficoltoso per il carattere idrofobico dell’interfaccia di binding e per la mancanza di pocket che rappresentino un binding site per potenziali farmaci. Nel laboratorio di Drug discovery e biotecnology(Unimore), da precedenti studi di virtual screening (libreria ChemDiv) e di dinamica molecolare, sono emersi 6 hit compounds che hanno mostrato un EC5o≈40μM in saggi di mortalità cellulare. Tra questi, il composto D361 mantiene stabili la conformazione e le interazioni cruciali nella simulazione di dinamica molecolare in complesso con TEAD. Lo scaffold di base del composto è riportato nel patent del gruppo di J.M.G.Cals et al. L’obiettivo di questo lavoro è validare il risultato dei precedenti studi modificando lo scaffold identificato attraverso il concetto di drug-repurposing. A questo scopo ho svolto le seguenti attività:1.Progettazione di nuovi composti derivati D361 mediante metodiche di analisi visuale di strutture cristalline tramite Maestro e Pymol. Si è analizzato l’intorno amminoacidico al fine di determinare le interazioni D361-interfaccia3 di TEAD, e opportune sostituzioni dello scaffold che permettessero di aumentare l’affinità per il sito di legame.2. Sintesi di 10 derivati studiati. Per la sintesi dei composti derivati D361, si è ottimizzata la via sintetica che consiste di due step, una sintesi di Williamson ed una reazione multicomponente. 3. Studio del profilo biologico su linee tumorali HT29 e A2780/CP. Il test d’inibizione della crescita cellulare delle linee HT29(adenocarcinoma colonrettale 5FU-resistente), ha permesso d’dentificare un hit, YAPT-21, con EC50=11.5μM. Sul composto più promettente è in programma uno screening di luminescenza della Luciferasi, per quantificare l’espressione differenziale di geni regolati dal complesso YAP-TEAD in presenza/assenza dell’inibitore. Inoltre, è in corso un saggio microcalorimetrico a titolazione isotermica(microITC) per una misura diretta delle costanti termodinamiche (Kd,ΔH,ΔS) della reazione d’interazione YAPT21-TEAD. I risultati riguardano la validazione dell’hit dal lavoro di virtual screening su TEAD, la messa a punto della reazione di sintesi di derivati D361 e la proposta di un seed project per lo sviluppo di nuovi inibitori di TEAD ad azione antitumorale.B)In collaborazione con ProlynxINC. si è attuato lo scale-up e l’ottimizzazione di una via sintetica a 5 steps, svolti in atmosfera inerte, che ha come prodotto un linker-carbamato suscettibile di βeliminazione per la coniugazione con il PEG di un inibitore della poliADPribosiopolimerasi, Talazoparib, migliorandone notevolmente l'attività in vivo.
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