Riassunto analitico
La timidilato sintasi umana (TS) catalizza la sola via di biosintesi della desossitimidina monofosfato, uno dei mattoni del DNA. Essa svolge quindi un ruolo chiave nella proliferazione delle cellule tumorali e suoi inibitori sono entrati in protocolli clinici per il trattamento di diversi tipi di tumore (es., il carcinoma del colon-retto, il mesentelioma, il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSLC)). Tuttavia tali chemioterapici, ad es. il 5-fluorouracile o il methotreaxate, che legano TS nel sito catalitico, inducono spesso sviluppo di resistenza ai farmaci antitumorali. Di qui la necessità di nuove strategie terapeutiche basate anche su inibitori di TS con meccanismi d’azione diversi. Una di tali nuove strategie si fonda su inibitori allosterici di TS che agiscono destabilizzando la forma dimerica della proteina, l’unica cataliticamente attiva, a favore dei due monomeri inattivi.
Nella prima parte del mio lavoro di tesi ho purificato la timidilato sintasi attraverso culture di batterio E.Coli BL21 trasformati in precedenza con un plasmide pQE80L. Ho poi proceduto a coniugare la proteina con due sonde fluorescenti che danno trasferimento di risonanza di energia d’eccitazione (FRET) quando vicine l’una all’altra nel dimero di TS. In presenza di inibitori dissociativi della proteina dimerica, l’efficienza di FRET, che non può avvenire fra sonde legate a monomeri separati, diminuisce. L’ultima parte del lavoro è consistita nella misura di tale efficienza in presenza di potenziali inibitori dissociativi di TS a diverse concentrazioni e nell’analisi dei risultati alla luce di un modello cinetico e termodinamico di inibizione dissociativa.
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Abstract
Human thymidylate synthase (TS) catalyzes the only biosynthetic route to desoxythymidyne monophosphate, one of the building blocks of DNA. Thus, it plays a key role in the proliferation of cancer cells and some of its inhibitors are included in clinical protocols for treatment of several tumour type (e.g., clo-rectal carcinoma, mesenthelioma, non-small cell lung cancer). However, such TS-catalytic-pocket-targeting drugs as 5-fluorouracil and methotrexate often induce drug-resistance onset. Hence the need for novel therapeutical strategies also based on TS inhibitors with different mechanisms of action. One of these strategies relies on allosteric TS inhibitors that destabilize the active, dimeric assembly of the enzyme in favour of the inactive monomers.
I first purified TS using BL21 E.Coli cultures previously transformed with a pQE80L plasmid. Then, I conjugated the protein with two fluorescent probes able to transfer fluorescence excitation energy (FRET) from one to the other when close to each other in the TS dimer. Because FRET cannot occur between probes bound to far-apart protein monomers, in the presence of TS-dimer disrupting inhibitors, the FRET efficiency decreases. So, I measured such an efficiency in the presence of potential TS dissociative inhibitors at different concentrations and finally analyzed the results using a kinetic and thermodynamic model of dissociative inhibition.
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