Riassunto analitico
La ditta Opocrin S.p.A. dal 1964 si occupa di ricerca, produzione e commercializzazione di materie prime ad uso farmaceutico. Prodotti salvavita come le eparine, eparine a basso peso molecolare e surfattante polmonare costituiscono i principi attivi di maggiore interesse per la compagnia. Opocrin S.p.A. ha inoltre implementato la propria offerta mediante la produzione di complessi di ferro quali sodio saccarato ferrico e proteina ferrica.
Una linea di ricerca della ditta è intesa allo sviluppo di un principio attivo, a base di acidi nucleici a basso peso molecolare ad attività fibrinolitica.
Di recente la ditta ha sviluppato un metodo analitico per valutare l’attività del principio attivo sul prodotto finito e su intermedi del processo produttivo, tuttavia, per la determinazione dell’attività in vitro si è creata l’esigenza di sviluppare e convalidare un nuovo metodo da affiancare al quello già precedentemente sviluppato.
A seguito di un’accurata ricerca bibliografica è stato individuato, come base di partenza per lo sviluppo di un metodo da adottare in Opocrin, il metodo descritto nel brevetto US 7,378,777. Esso si basa sull’attivazione dell’enzima fibrinolitico Plasmina da parte del Defibrotide, farmaco ad attività simile al prodotto dell’azienda.
In breve, la Plasmina posta a contatto con il Defibrotide, o altra miscela di acidi nucleici, si attiva. L’attivazione è valutata, sulla base della quantità di p-nitroanilina (p-Na) rilasciata dalla reazione con il substrato cromogenico H-D-Valyl-L-Leucyl-L-Lysine-p-nitroaniline (S-2251), mediante letture spettrofotometriche.
Lo studio è iniziato con la fase di messa a punto del metodo, dove sono state apportate modifiche alla procedura descritta nel brevetto, in modo da renderla più adatta agli scopi prefissati e agli strumenti in possesso della Ditta.
Successivamente, nella fase di pre-convalida, si sono individuate le condizioni di misura più opportune, stabilendo anche il metodo di calcolo più opportuno con cui risalire all’attività di principio attivo, espresso in Unità/ml di prodotto.
In questa fase si sono stabiliti i parametri da valutare in sede di convalida ed è stato redatto un Protocollo di Convalida Ufficiale, definendone i parametri analitici (linearità, working range, precisione, specificità e robustezza) ed i criteri di accettazione degli stessi.
La convalida del metodo, per quanto riguarda i parametri di linearità, working range, precisione e robustezza, è stata effettuata mediante l’utilizzo di Defitelio (defibrotide), un orphan drug commercializzato da Gentium S.p.A. per il trattamento della “Hepatic Veno Occlusive Disease” (VOD): un lotto di Defitelio è stato considerato come standard, mentre un secondo lotto è stato considerato come campione. Nello studio della specificità del metodo, oltre ad alcuni campioni di acidi nucleici reperiti in commercio, sono stati valutati anche campioni Opocrin a vario peso molecolare e ottenuti in varie condizioni sperimentali.
Durante lo sviluppo e in sede di convalida è stato utilizzato il foglio di calcolo CombiStats (fornito da EDQM), nel quale viene applicato il modello di calcolo a rette parallele per valutare l’attività del campione in confronto allo standard. Esso, sulla base di test statistici come l’analisi della varianza (ANOVA), permette di accertare l’accuratezza di ogni dosaggio, mediante la valutazione di alcuni parametri, che devono essere rispettati per ogni singolo test.
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