Riassunto analitico
Studi recenti hanno identificato l’interazione tra i sistemi proteolitici presenti nel sangue del complemento, parte del sistema immunitario, e della coagulazione. Nonostante ciò, i meccanismi molecolari delle loro interazioni e l’impatto della proteolisi sull’attivazione e l’amplificazione di ciascun sistema non sono ad ora noti.
Un’analisi proteomica longitudinale ha dimostrato che le proteine plasmatiche, sia della cascata del complemento che della coagulazione, sono espresse in modo differenziale all’età di 12 anni nelle persone che svilupperanno disordini psicotici a 18 anni, risultando in un fenotipo potenzialmente procoagulante e proinfiammatorio.
La disregolazione dell’interazione tra coagulazione e complemento potrebbe contribuire all’iper- o ipoattivazione di questi ultimi e richiede un’attenta caratterizzazione. Per essere in grado di determinare accuratamente l’attività del complemento, tenendo in considerazione queste interazioni, è richiesto un saggio che includa i fattori della coagulazione. Tuttavia, l’attività del complemento è stata tradizionalmente misurata in siero umano defibrinato, dove i fattori della coagulazione sono stati attivati e consumati durante il processo stesso della coagulazione. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare un nuovo saggio in plasma, per determinare l’attività del complemento in presenza delle proteine della coagulazione. Inizialmente è stato testato l’effetto di numerosi anticoagulanti sull’attività emolitica del complemento, mediante saggi emolitici standard, utilizzando siero umano.
Gli anticoagulanti che non alteravano l’emolisi in siero sono stati quindi utilizzati successivamente per preparare plasma anticoagulato a partire da sangue intero. Il plasma anticoagulato è stato paragonato al siero, mostrando simile attività emolitica.
Successivamente, abbiamo voluto studiare l’influenza di specifici fattori della coagulazione sull’attività emolitica del complemento utilizzando plasma citrato, a cui sono stati rimossi separatamente i fattori della coagulazione FXI, FXII, fibrinogeno, plasminogeno o protrombina, rilevando che il plasma senza plasminogeno o senza FXI influenzavano la lisi delle cellule mediata dal complemento. Infine abbiamo monitorato la torbidità del coagulo di fibrina che si generava in plasma senza plasminogeno, in seguito all’aggiunta di proteine sia del complemento che della coagulazione, per testare il loro impatto sulla formazione del coagulo.
In conclusione, abbiamo sviluppato un nuovo saggio in plasma per la misurazione dell’attività emolitica del complemento. Abbiamo dimostrato che il FXI e il plasminogeno potrebbero avere un potenziale effetto sull’attività del complemento e che la formazione del coagulo di fibrina è alterata in presenza di componenti del complemento e della coagulazione che sono disregolati nei disordini psicotici.
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Abstract
Recent studies have identified molecular interplay between the blood based proteolytic systems of complement immunity and coagulation. However, molecular mechanisms of their interactions and the impact of proteolysis on the activation and amplification of each system are not clear.
A longitudinal proteomic analysis showed that plasma proteins from both complement and coagulation cascades are differentially expressed in people at age 12 developing psychotic disorders at age 18, resulting in a potentially proinflammatory and procoagulant phenotype. Coagulation and complement crosstalk dysregulation may contribute to the over-or under-activation of these system and requires careful characterisation. To be able to accurately determine complement activity, while taking into account complement and coagulation crosstalk, an assay incorporating coagulation factors is required. However, complement activity has been traditionally measured in defibrinated normal human serum, where coagulation factors are activated and consumed in the clotting process. The aim of this study was to develop a novel plasma-based assay, to determine complement activity in presence of coagulation proteins. First, the effect of several anticoagulants on complement hemolytic activity was tested in standard complement hemolytic assays using normal human serum. Anticoagulants which did not alter hemolysis in serum were then taken forward to prepare anticoagulated plasma from whole blood. Anticoagulated plasma was compared to standard normal human serum and showed similar hemolytic activity.
Next, we wanted to study the influence of specific coagulation factors on complement hemolytic activity using citrated plasma depleted of coagulation components FXI, FXII, fibrinogen, plasminogen or prothrombin and found that FXI and plasminogen depleted plasma affected complement mediated cell lysis. Finally, we monitored turbidity of fibrin clot generation in plasminogen depleted plasma with added complement and coagulation proteins, in order to test their impact on fibrin clot formation.
In conclusion, we developed a novel anticoagulated plasma-based complement hemolytic assay. Further, we showed that FXI and plasminogen may have a potential influence on complement activity and that fibrin clot formation is altered in the presence of coagulation and complement components dysregulated in patients with psychotic disorder.
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