Riassunto analitico
I fattori trascrizionali MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) sono presenti in quattro diverse isoforme nei vertebrati, tra questi MEF2C possiede un ruolo centrale nel differenziamento muscolare. Per individuare quali modificazioni post traduzionali potessero influenzare l’attività di MEF2C nel nostro laboratorio è stata effettuata un’analisi di spettrometria di massa, che ha permesso di individuare due nuovi siti fosfoaccettori: Ser 98 e Ser 110. La fosforilazione di queste due serine si è rilevata fondamentale per l’interazione con la peptidil prolil cis/trans isomerasi Pin1 che agisce come inibitore dell’attività di MEF2C nelle cellule muscolari scheletriche, riducendone la stabilità e l’attività transattivante. Attraverso esperimenti di transattivazione è stato dimostrato che la fosforilazione di Ser98 e Ser110 ha un effetto repressivo sull’attività trascrizionale di MEF2C, confermando il modello di regolazione negativa fosforilazione-dipendente ad opera di Pin1. Inoltre, grazie all’utilizzo di anticorpi fosfo-specifici, abbiamo rilevato che il livello di fosforilazione di Ser98 e Ser110 è elevato in mioblasti, cellule muscolari in attiva proliferazione, e diminuisce in seguito al differenziamento. Per verificare se tale fosforilazione sia modulata nel corso del ciclo cellulare, cellule muscolari murine C2C7 sono state sincronizzate e verificando che i livelli proteici di MEF2C subiscono una drastica riduzione, in concomitanza con l’incremento della fosforilazione di Ser 98 in mitosi. Tali osservazioni suggeriscono che MEF2C possa rivestire un ruolo nelle cellule proliferanti e la sua modulazione in fase M potrebbe significare che MEF2C contribuisce alla regolazione del ciclo cellulare. Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato di analizzare la funzione di MEF2C nel ciclo attraverso le seguenti strategie: - verificare se gli eventi di fosforilazione di Ser 98 e Ser110 possano regolare la stabilità della proteina e identificare il meccanismo alla base della modulazione dei livelli di proteina. - verificare se MEF2C ed in particolare la sua degradazione in fase M, abbia un ruolo funzionale nella progressione del ciclo cellulare attraverso esperimenti di modulazione della sua espressione. A questo scopo ho utilizzato la metodica del silenziamento genico tramite gli small interfering RNA (siRNA) e tramite Short Hairpin RNA, in parallelo ho allestito esperimenti di sovraespressione della proteina MEF2C e dei mutanti sui siti di fosforilazione, che hanno permesso di ipotizzare un ruolo di MEF2C e della sua fosforilazione nella progressione del ciclo cellulare. In sintesi i risultati dei nostri esperimenti suggeriscono un coinvolgimento dei siti fosfoaccettori Ser98 e Ser110 nella degradazione della proteina che avviene grazie all'intervento del Anaphase Promoting Complex (APC/C). Nel laboratorio sono in corso esperimenti volti a chiarire i meccanismi molecolari di questa degradazione. I risultati preliminari degli esperimenti di sovraespressione di MEF2C e del suo mutante sui siti fosfoaccettori indicano che la degradazione di MEF2C in M sia necessaria per la progressione in mitosi. Ho inoltre messo a punto le condizioni di silenziamento genico di MEF2C attraverso l'uso dei siRNA specifici che permetteranno di verificare se MEF2C è necessario per la progressione nel ciclo, rivelando un potenziale nuovo aspetto funzionale di questo fattore di trascrizione noto per la sua funzione nel differenziamento miogenico terminale.
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