Riassunto analitico
L’espressione di epcidina, l’ormone regolatore del metabolismo del ferro, è modulata da diverse vie e da diversi stimoli all’interno della cellula. Il fine ultimo di questa modulazione è quello di garantire la corretta omeostasi ed il corretto bilancio del ferro in circolo.
La quantità circolante di questo ormone, prodotto dagli epatociti, è finemente regolata a livello trascrizionale.
Esistono in particolare tre vie che ne regolano la produzione:
- la via delle BMPs (Bone Morphogenetic Proteins), che attraverso la fosforilazione e la conseguente attivazione delle proteine SMAD, attiva il promotore dell’epcidina;
- la via di risposta allo stress del reticolo endoplasmatico, che aumenta i livelli di espressione dell’epcicina attraverso l’attivazione del fattore trascrizionale CREBH;
- la via infiammatoria, attivata dalla citochina IL-6 (interleuchina 6) che è in grado di indurre una risposta trascrizionale dell’epcidina a seguito della fosforilazione e del successivo legame del fattore STAT3 al promotore stesso.
Fino ad ora si riteneva che queste diverse vie di stimolazione agissero in maniera indipendente, attivando meccanismi differenti e legandosi con i propri effettori finali a specifiche regioni del promotore.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di indagare l’esistenza di possibili interazioni tra queste diverse vie di regolazione dell’espressione dell’epcidina.
Nella prima parte dello studio si è presa in analisi la via di regolazione dell’infiammazione mediata dalla citochina IL-6.
Per dimostrare l’azione diretta di questa citochina sull’attivazione trascizionale si è utilizzato un inibitore diretto (Tocilizumab) della via di segnalazione IL-6-dipendente, in grado di bloccarne il recettore a livello della membrana plasmatica. E’ stato quindi condotto uno studio di espressione genica trattando linee cellulari epatocitarie umane (HepG2) con IL-6 e tocilizumab per evidenziare l’effettiva diminuzione del messaggero dell’epcidina. Inoltre è stato clonato un frammento del promotore dell’epcidina murino in fusione con il gene reporter della firefly luciferase recante una mutazione nella regione del promotore responsiva allo STAT3: di questo costrutto è stata valutata l’attività in HepG2 allo scopo di controllare l’effettivo coinvolgimento della via IL-6/STAT3 nella regolazione del promotore. Questo lavoro iniziale ha permesso di confermare l’effettivo coinvolgimento della regione legante lo STAT3 nel promotore nella regolazione dell’epcidina.
Per indagare se questa via di stimolazione fosse influenzata dalla via delle BMP, le principali regolatrici dell’epcidina in risposta al ferro, è stato utilizzato LDN-193189 come bloccante della via delle BMPs. Questa molecola è in grado di inibire in modo specifico la via di stimolazione BMP-dipendente interagendo con il recettore a livello extracellulare.
L’uso di LDN-193189 ci ha permesso di constatare che bloccando la via BMP, si ha inibizione dell’espressione dell’epcidina sia di base che sotto stimolo infiammatorio.
Visti gli interessanti risultati ottenuti, nella seconda parte dello studio abbiamo preso in esame la regolazione dell’ormone in risposta allo stress del reticolo. Mediante studi di espressione genica con Real Time PCR in HepG2, si è dimostrato come la LDN-193189 sia sufficiente a bloccare l’espressione di epcidina anche durante il trattamento con tunicamicina e A23187, noti induttori dello stress del reticolo e della trascrizione di epcidina.
In ultima analisi questo studio ha permesso per la prima volta di collegare vie di segnalazione che fino ad ora si riteneva agissero in modo indipendente sul promotore dell’epcidina, chiarendo il ruolo cruciale e gerarchicamente prioritario della via BMP nella regolazione trascrizionale dell’ormone del ferro.
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