Riassunto analitico
È risaputo che il drug discovery è un processo lungo e dispendioso che ha sfruttato diversi strumenti per accelerare i tempi, tra cui la proteomica che si è rivelata essere uno strumento utile ad identificare e caratterizzare una vasta gamma di proteine espresse in varie matrici biologiche. Inoltre, la proteomica permette di capire meccanismi fisiologici e patologici, e di identificare nuovi target e biomarker, dati non ottenibili dal solo genoma. Il drug discovery affronta il crescente fenomeno della resistenza che pone gravi limitazioni ai farmaci, dagli antibatterici agli antitumorali, in molte applicazioni cliniche. La resistenza ai farmaci nasce durante la terapia o è intrinseca nelle cellule tumorali o patogene, quindi bisogna trovare strumenti adeguati a capire i meccanismi di sviluppo delle malattie e della resistenza. Perciò è stato scelto un approccio proteomico a due patologie: A), identificazione delle proteine modulate in cellule infettate con linee resistenti di Leishmania (L.) dopo il trattamento, e ricerca del loro coinvolgimento nel fenotipo di resistenza; B), identificazione e caratterizzazione di set di proteine legate alla risposta al trattamento di pazienti con cancro ovarico (OC). In entrambi i casi, è stato disegnato un esperimento label-free bottom-up total proteomics, con un approccio differenziale per studiare due diversi gruppi, con l'obiettivo di trovare proteine che fungano da nuovi biomarker o target, e progettare nuovi farmaci. Entrambi i progetti sono in linea con la sfida UN2030, poiché cercano di arginare due malattie di interesse globale. A) L'Istituto di Parassitologia e Biomedicina López-Neyra (IPBLN) ha fornito cellule THP-1 infettate con vari ceppi di L. infantum dai pazienti (alcuni resistenti ai farmaci, altri con fallimento terapeutico). I dati grezzi dei campioni preparati per l'UPLC-HRMS sono stati sottoposti ad analisi qualitativa e quantitativa dei dati e analisi differenziale (ANOVA), dando una lista più breve di proteine. L'obiettivo specifico della mia tesi era quello di fare un'ipotesi sulla correlazione tra la resistenza ai farmaci e il set di proteine identificate. Per ottenere ciò, ho eseguito queste attività: 1) Ho scelto diversi strumenti bioinformatici per analizzare i risultati della proteomica e della trascrittomica di IPBLN. 2) Dai risultati, ho cercato strumenti funzionali e proteomici per la validazione delle due proteine più rilevanti. Di seguito i risultati: per gli 8 casi sono state trovate 44 proteine differenzialmente espresse (DEPs), e accoppiate con 18 geni differenzialmente espressi (DEGs), per un totale di 60 elementi. I software STRING e PANTHER hanno permesso processi di network enrichment e clustering, per vedere tutte le interazioni proteina-proteina esistenti. Le 2 DEPs trovate nei due dataset sono: recettore della transferrina e nucleoside difosfato chinasi, le cui pathway metaboliche sono sfruttate dal parassita per vivere nell'ospite. Sono ora in corso esperimenti per validare i livelli delle proteine e il loro ruolo funzionale: il primo prevede un Western Blot, il secondo richiede la somministrazione di chemical probes che ho identificato tramite l'analisi dei metadati come sostanze in grado di legare le proteine, provando il loro ruolo in infezione, resistenza e fallimento terapeutico. B) Mito16A è uno studio clinico in pazienti con OC epiteliale allo stadio III-IV trattati con carboplatino/paclitaxel con o senza bevacizumab. L'obiettivo era quello di capire con approcci traslazionali se fattori clinici e biologici potessero identificare i pazienti con una prognosi migliore. La mia tesi nasce dal lavoro in corso su campioni di siero basale di 32 pazienti, la cui analisi MS aveva portato a identificare 6 proteine. I metadati sono stati combinati con la ricerca di chemical probes in grado di legare le DEPs. È in corso un test ELISA per verificare i livelli nei campioni delle proteine identificate dalle tecniche proteomiche.
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Abstract
It is widely known that drug discovery is a time-consuming process, and over the years it has drawn on diverse tools in its attempt speed up the pace, amongst which proteomics that have evolved into an improved tool for simultaneously identifying and characterizing a broad range of expressed proteins in diverse biological matrices. Also, proteomics enables to clarify physiological and pathological mechanisms, and to identify novel drugs target and biomarkers, data not achievable via the genome alone. Drug discovery deals with the rising phenomenon of resistance, which places severe limitations on various chemical compounds, from antibacterial to anticancer, in different clinical indications. Drug resistance arises during therapy or is intrinsic in tumour or pathogen cells, thus it is necessary to find appropriate tools to comprehend the mechanisms underlying the development of diseases and resistance. Hence, the rational for choosing a proteomics approach to two pathological conditions: A), the identification of modulated proteins in cells infected with resistant Leishmania (L.) lines after treatment, and search for their involvement in resistance phenotype; B), the identification and characterisation of set of proteins linked to the response to treatment of ovarian cancer (OC) patients.In both case studies, a label-free bottom-up total proteomics experiment, with a differential approach to study two different groups, was designed aiming at finding the set of proteins to serve as new potential biomarkers or new druggable targets, and designing novel drugs. Both projects match the UN2030 challenge, as they try to overcome two diseases of global concern. A) The Institute of Parasitology and Biomedicine López-Neyra (IPBLN) provided THP-1 cells infected with different strains from L. infantum patients (some resistant to drugs, other with a therapeutic failure outcome). Instrumental raw data from samples prepared for UPLC-HRMS underwent qualitative and quantitative data management, and differential analysis (ANOVA), leading to a shorter list of proteins. The specific objective of my thesis was to develop a working hypothesis on the correlation between drug resistance and the protein set identified. To achieve this, I performed these tasks: 1) I adopted different bioinformatic tools to analyse the outcomes both from proteomics and IPBLN transcriptomics. 2) Based on the results, I searched for functional and proteomic tools for the validation of the two most relevant proteins. Results of this work were as follows: for the 8 cases, 44 proteins were found differentially expressed (DEPs), and coupled with 18 differentially expressed genes (DEGs), to a panel of 60 elements. STRING and PANTHER software allowed network enrichment and clustering processes, to visualise all existing protein-protein interactions. The 2 DEPs retrieved in both datasets from the initial panel were Transferrin Receptor Protein and Nucleoside Diphosphate Kinase, whose metabolic pathways were exploited by the parasite for its persistence inside the host. Experiments are now in progress for validation of proteins’ levels and their functional role: the first involves a Western Blot, the second requires administering chemical probes that I identified via metadata analysis as proteins binders, proving protein role in infection, resistance, and therapeutic failure. B) Mito16A is a multicentre clinical study in stage III-IV epithelial OC patients treated with carboplatin/paclitaxel with or without bevacizumab. The aim was to explore with translational approaches whether clinical and biological factors could identify patients with better prognosis. My thesis stems from ongoing work on basal serum samples from 32 patients, whose MS analysis had led to identify 6 proteins. Metadata were combined with the quest for chemical probes able to bind the DEPs. It is ongoing an ELISA test to verify the levels in samples of these proteins identified by proteomic techniques.
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