Riassunto analitico
Negli ultimi decenni si è assistito ad una progressiva riduzione degli investimenti nella produzione di nuovi antibiotici, nonostante il loro uso sia aumentato anche grazie al fenomeno dell'antibiotico resistenza. Inibitori dell'acido lipoteicoico sintasi (LtaS), un enzima responsabile della sintesi dell'acido lipoteicoico (LTA) che si trova nella parete dei batteri Gram positivi, potrebbe rappresentare un'efficace arma contro questi organismi. Un composto denominato come 1771 è stato indicato come potenziale inibitore di LtaS, ma la sua modalità di azione presenta punti oscuri. In questo progetto di tesi, lo scopo era quello di sintetizzare derivati di 1771, in modo da migliorarne la stabilità e l'attività biologica. Inoltre, dal momento che la prima strategia di sintesi di 1771 aveva portato ad un altro composto, in questo progetto di tesi viene proposto un possibile meccanismo che ne spieghi la formazione e un eventuale procedimento analitico per caratterizzarne la struttura. La strategia per sintetizzare 1771 e derivati è stata sviluppata grazie a ricerche bibliografiche. Diversi composti sono stati sintetizzati e caratterizzati usando tecniche di analisi come MS e NMR. Tuttavia, a causa della pandemia da COVID19, non è stato possibile perseguire questo obiettivo fino alla fine. L'attività inibente di 1771 e di suoi possibili metaboliti è stata investigata misurandone la minima concentrazione inibente (MIC) nei confronti di diversi ceppi di Staphylococcus aureus e Enterococcus faecium. Inoltre, per fare luce sulla possibilità che effettivamente 1771 leghi LtaS sono state effettuate delle analisi in silico mediante il software AutoDock Vina. La MIC di 1771 è risultata essere uguale o minore di quella della Vancomicina, un antibiotico spesso usato come ultima linea terapeutica. Inoltre, i possibili metaboliti derivanti da 1771 non hanno mostrato alcuna attività inibente alle concentrazioni utilizzate. Le analisi effettuate mediante il software AutoDock Vina hanno rivelato una conformazione di 1771 che, interagendo con diversi amino acidi, alcuni anche profondamente coinvolti nel meccanismo di azione di LtaS, potrebbe spiegare come il composto impedisca l'accesso al sito attivo dell'1-glicerolfosfato, il substrato dell'enzima.
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Abstract
Recent decades has seen a decrease in antibiotic development, despite greater their demand because of antibiotic resistance. Targeting of lipoteichoic acid synthase (LtaS), an enzyme responsible of synthesising lipoteichoic acid (LTA) in Gram positive bacterial cell walls, could help address this problem. Compound 1771 has been proposed as an LtaS inhibitor, although its activity remains unclear. In this study, we aimed to report the synthesis of more stable and active analogues, evaluate its activity as an inhibitor of bacterial growth, and evaluate its affinity through in silico investigation. Finally, since the first synthetic strategy to obtain compound 1771 led to a different compound, a putative reaction mechanism and a method to asses the structure of the unknown compound has been proposed. The synthetic strategy for compound 1771 and analogues was developed through bibliography research. Different compounds were synthesised and characterised using NMR and MS. Unfortunately, because of the COVID19 pandemic, this experimental work could not be carried out until the end. The inhibitory activity of compound 1771 and its putative metabolites was investigated by standard broth microdilution measurement of minimum inhibitory concentration (MIC) against strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium. To ascertain if compound 1771 could bind LtaS in silico evaluation was performed using the AutoDock Vina software. MIC testing resulted in compound 1771 equivalent antimicrobial effects or better compared with Vancomycin, which is used as last resort drug to treat several Gram-positive bacterial infections. Testing putative metabolites derived from compound 1771 revealed that these fragments lacked inhibitory activity at the investigated concentrations. In silico analysis identified that a conformation of compound 1771 that could occupy the LtaS binding site and facilitated via H-bonds and pi-interactions. The outcome of this would be prevention of 1-glycerol phosphate, the natural substrate of LtaS, entering the active site. Having achieved a synthetic strategy to obtain compound 1771 could allow the development of compound 1771 and its derivatives with enhanced activity and stability. The results demonstrated that antimicrobial effects of 1771 was dependent on the intact molecule and not any of its putative metabolites.
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